骨碎補總黃酮通過SDF1/CXCR4信號途徑促進小鼠骨髓基質細胞ST-2遷移

吳紫璇，郝征，郭亞萍，張翟軼，陳璐瑤，彭雁飛△，鄭紡△

全世界范圍內因交通事故、工傷、運動創傷或疾病等原因造成的骨缺損、骨折的傷患人數每年高達幾百萬。由于骨結構的特殊性，即使能夠愈合，亦常需要長達幾周甚至幾個月的固定、限制活動，往往會導致肢體廢用性萎縮、關節粘連、褥瘡、呼吸及泌尿系感染等多種并發癥，極大影響了患者的勞動能力和生活質量。目前臨床上多采用骨組織工程學技術來治療該類疾病，即將體外培養的高濃度種子細胞種植于人工或天然合成的細胞外基質載體上，并復合相關誘導因子，然后移植于體內，從而達到修復骨缺損的目的。然而，近年來研究發現，即使是利用傳統組織工程學修復骨缺損也存在著免疫排斥等缺陷［1］，因此尋找安全有效的治療骨缺損方法成為目前骨傷科治療領域的熱點。

骨碎補是骨傷科的常用中藥，多用于治療骨相關疾病，具有很好的療效。骨碎補總黃酮（assemble flavone of rhizome drynaria，AFRD）是骨碎補的主要有效成分，動物實驗證明，AFRD能夠提高廢用性骨質疏松大鼠的骨組織體積、骨小梁密度和厚度［2］。同時有研究表明，基質細胞衍生因子1/趨化因子受體4（SDF1/CXCR4）信號途徑與骨缺損修復和骨形態發生蛋白2（BMP2）誘導的骨髓基質細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）遷移密切相關，能夠參與骨缺損部位的骨再生［3］。此外，SDF1/CXCR4信號途徑本身也能夠促進骨髓基質細胞遷移至受損部位，參與骨缺損修復。然而，骨碎補治療骨缺損的作用是否與其促進骨髓基質細胞遷移及SDF1/CXCR4信號途徑相關，目前鮮有報道。因此，本研究以乙醇超聲法從強骨膠囊中獲取AFRD，以小鼠骨髓基質細胞系ST-2為研究對象，觀察AFRD對ST-2細胞遷移及SDF1/CXCR4信號途徑的調節作用，以期為揭示骨碎補治療骨缺損的作用機制提供研究依據。

1 材料與方法

1.1實驗材料 強骨膠囊（主要成分為AFRD，每250 mg強骨膠囊含AFRD不少于180 mg）購自北京岐黃制藥公司；α-MEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；Trizol LS購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒購自美國Applied Biosystems公司；定量PCR試劑盒購自哈爾濱新海基因檢測有限公司；CXCR4抗體、GAPDH抗體購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔、山羊抗鼠抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 小鼠骨髓基質細胞系ST-2培養于含有10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的α-MEM培養基中，于在37℃、5%CO2條件下培養。每隔2 d換液1次。待細胞匯合至80%左右時進行傳代。

1.2.2CCK-8法檢測ST-2細胞增殖 使用0.25%的胰蛋白酶消化ST-2細胞，制成單細胞懸液，以1×105個/mL的密度將細胞接種至96孔板中，而后將細胞放入培養箱內繼續培養24 h。分別使用對照試劑DMSO（control）和不同濃度（5、20、50、100 mg/L）的AFRD處理細胞0、24、48和72 h，每種處理設置3個復孔。干預期滿后，根據CCK-8試劑盒說明，在每孔培養基中加入10%CCK-8溶液，在培養箱中繼續孵育1 h。使用酶標儀檢測各孔培養基在450 nm處的光密度（OD）值，評價AFRD對ST-2細胞增殖的影響。

1.2.3Transwell法檢測ST-2細胞的遷移 將Transwell小室放置于24孔板中，消化ST-2細胞，以含不同濃度AFRD的無血清培養基重懸細胞，并以5×104個/mL的密度將細胞接種于Transwell上室。在下室中加入含10%FBS的培養基以形成營養梯度，并于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h。待培養期滿后，吸棄Transwell上室中的培養基，并用棉簽蘸除上室的細胞，將小室置于4%多聚甲醛中室溫下固定1 h，取出小室風干后，使用0.01%的結晶紫染色30 min，用PBS漂洗2次去除浮色。晾干小室后，將其置于倒置顯微鏡下拍照、計數，使用Image J軟件進行細胞計數分析，計算細胞遷移率，遷移率=（24 h穿膜細胞數-0 h穿膜細胞數）/0 h穿膜細胞數×100%，評價不同濃度AFRD對細胞遷移的影響。

1.2.4熒光定量PCR檢測SDF1和CXCR4的基因表達 使用不同濃度的AFRD（5、20、50、100 mg/L）干預ST-2細胞48 h，使用細胞提取RNA，逆轉錄獲得cDNA單鏈，逆轉錄條件為25℃ 10 min，37℃ 30 min，42℃30 min，85℃5 min。逆轉錄具體操作步驟按Applied Biosystems公司TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒說明書進行。以cDNA為模板，GAPDH作為內參基因，熒光定量PCR檢測SDF1和CXCR4的mRNA表達。反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火10 s，共45個循環。每組設置3個復孔，目的基因相對表達量用2-ΔΔCt計算。熒光定量PCR擴增的基因引物序列見表1。

Tab.1 Amplification of gene primers by fluorescence quantitative PCR表1 熒光定量PCR擴增基因引物序列

1.2.5Western blot檢測CXCR4的蛋白表達 不同濃度的AFRD（5、20、50、100 mg/L）干預ST-2細胞72 h后，使用RIPA蛋白裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白并使用BCA蛋白定量法檢測濃度。10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜上。PBST漂洗后，于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h。封閉結束后用PBST漂洗，加入CXCR4一抗（稀釋比例1∶2 000），4℃孵育過夜。將膜取出放入PBST溶液中，搖床震蕩漂洗3次，每次5 min。加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。孵育結束后使用PBST漂洗3次，每次15 min。加入顯影液拍照，以GAPDH為內參。

1.2.6CXCR4抑制劑AMD3100干預實驗 使用50 mg/L AMD3100干預ST-2細胞，Transwell實驗觀察SDF1/CXCR4信號途徑阻斷后，AFRD對ST-2細胞遷移作用的變化，熒光定量PCR和Western blot檢測AFRD對ST-2細胞中SDF1和CXCR4基因表達水平的影響。

1.3統計學方法 使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，實驗數據采取均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和重復測量資料方差分析，組間多重比較采用Dunnett-t檢驗及LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1AFRD對ST-2細胞增殖的影響 對于CCK-8法檢測結果，經重復測量資料的方差分析，組別（F=26.680，P＜0.001）、時間（F=465.780，P＜0.001）、組別與時間的交互作用（F=7.785，P＜0.001）均有統計學意義，除5 mg/L外，20、50、100 mg/L AFRD處理24、48和72 h，ST-2細胞增殖明顯增加，與control組比較差異有統計學意義。見圖1。

Fig.1 Effects of AFRD on proliferation of ST-2 cells圖1 AFRD對ST-2細胞增殖的影響

2.2AFRD對ST-2遷移能力的影響 結果顯示，control組與5、20、50、100 AFRD組的ST-2細胞遷移能 力 差 異 有 統 計 學 意 義（n=6，F=229.882，P＜0.001）。5、20、50、100 mg/L AFRD干預ST-2細胞24 h后，與control組比較，ST-2細胞的遷移能力明顯提高，且隨濃度升高而增加，呈現濃度依賴性。見圖2。

Fig.2 AFRD promotes the migration of ST-2 cells圖2 AFRD促進ST-2細胞遷移

2.3AFRD對SDF1和CXCR4基因表達的影響

2.3.1AFRD對SDF1和CXCR4基因mRNA表達的影響 Control組與5、20、50、100 mg/L AFRD組的SDF1基因的mRNA表達差異有統計學意義（n=6，F=47.696，P＜0.001）。與control組相比，5、20、50、100 mg/L AFRD均可明顯上調ST-2細胞內SDF1基因的mRNA表達（P＜0.05），但各濃度AFRD上調SDF1的作用差異無統計學意義（P＞0.05）。各濃度AFRD均可明顯上調CXCR4基因的mRNA表達（n=6，F=35.147，P＜0.001），且隨濃度增加，上調作用越顯著，呈現出濃度依賴性，見圖3。

Fig.3 Effects of AFRD on mRNA expression of SDF1 and CXCR4圖3 AFRD對SDF1和CXCR4 mRNA表達的影響

2.3.2AFRD對CXCR4蛋白表達的影響 結果顯示，與control組比較，5、20、50、100 mg/L AFRD明顯上調ST-2細胞內CXCR4的蛋白表達（F=13.466，P＜0.001），并有隨AFRD的濃度增加，上調作用越顯著的趨勢。見圖4。

2.4AMD3100逆轉AFRD促ST-2細胞遷移和上調SDF1和CXCR4基因表達 選擇促ST-2細胞遷移作用最明顯的50 mg/L AFRD進行SDF1/CXCR4通路抑制實驗。Transwell實驗結果顯示，control組、50 mg/L AFRD組、50 mg/L AFRD+AMD3100組的ST-2細胞遷移能力差異有統計學意義（n=6，F=69.642，P＜0.001）。與50 mg/L AFRD組比較，CXCR4抑制劑AMD3100干預后，AFRD促進ST-2細胞遷移的作用被抑制（P＜0.001），見圖5。此外，control組、50 mg/L AFRD組、50 mg/L AFRD+AMD3100組的SDF1和CXCR4 mRNA表達差異有統計學意義（F值分別為224.339、1 428.424，P＜0.001），與50 mg/L AFRDz組比較，AMD3100抑制了AFRD對SDF1和CXCR4 mRNA表達的上調作用，見圖6。Control組、50 mg/L AFRD組、50 mg/L AFRD+AMD3100組的CXCR4的蛋白表達量的差異有統計學意義（F=5.733，P＜0.05），與50 mg/L AFRD比較，AMD3100抑制AFRD對和CXCR4蛋白的上調作用，見圖7。

Fig.4 AFRD promoted the protein expression of CXCR4 in ST-2 cells圖4 AFRD促進ST-2細胞中CXCR4的蛋白表達

Fig.5 AMD3100 blocked the migration of ST-2 cells induced by AFRD圖5 AMD3100阻斷AFRD促進ST-2細胞的遷移作用

3 討論

Fig.6 AMD3100 blocked the up-regulation effect on the mRNA expression of SDF1 and CXCR4 induced by AFRD圖6 AMD3100阻斷AFRD對SDF1和CXCR4 mRNA表達的上調作用

Fig.7 AMD3100 blocked the up-regulation effect on proteinexpression of CXCR4 induced by AFRD圖7 AMD3100阻斷AFRD對CXCR4蛋白表達的上調作用

3.1骨髓基質細胞的遷移及調控與骨損傷的關系 骨髓基質細胞是一類成體骨髓中的多能干細胞，能夠在適宜誘導條件下分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和其他幾種結締組織細胞（如腱細胞）等。在發生骨損傷時，盡管骨折斷端周圍也存在骨髓基質細胞，但僅能滿足輕度骨缺損或骨折修復的需要。對于嚴重或大塊的骨缺損，即使植入自體骨、異體骨或組織工程骨，除植骨周圍有少量細胞存活外，大部分骨缺損區域內缺乏足夠的骨髓基質細胞。顯然，骨損傷修復過程中，損傷局部聚集足夠數目的骨髓基質細胞是促進骨修復的前提條件和重要的細胞學基礎。趨化因子家族及其受體是操控骨髓基質細胞動員和遷移的重要因子。SDF1即CXCL12，屬于趨化因子家族中的CXC亞族，主要由骨髓基質細胞合成和分泌，具有強大的趨化作用，其特異性受體CXCR4在許多細胞表面表達。SDF1與其受體CXCR4構成的SDF1/CXCR4信號途徑在骨髓基質細胞的動員與定向遷移中發揮了重要作用［4］。發生骨損傷時，SDF1/CXCR4信號途徑能夠募集骨髓基質細胞趨化遷移到損傷部位，參與骨再生修復。

3.2AFRD治療骨損傷的具體作用機制尚不明確 《本草新編》記載：骨碎補，味苦，氣溫，無毒，入骨，用之以補接傷碎最神。歸肝、腎經，具有止痛、補腎、強骨的功效，主要用于治療跌撲閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨痿軟、牙齒松動等相關病癥［5］。臨床上骨碎補多用于治療骨質疏松癥及骨缺損等骨科相關疾病，具有很好的療效［6］。研究報道，大于1 000 mg/L的骨碎補不會引起斑馬魚內臟中毒，2 000 mg/L骨碎補對斑馬魚幼魚無毒性，這些結果有力證明了骨碎補的安全性［7］。骨碎補總黃酮是骨碎補主要活性成分，藥代動力學研究表明，給骨缺損模型鼠灌服骨碎補后，在動物血清中能夠檢測到包括黃芪苷、柚皮苷、木犀草素-7-o-β-d-葡萄糖苷在內的8種黃酮［8］。體內實驗表明，骨碎補總黃酮能夠提高股骨干缺損大鼠的骨密度，維持骨微結構的完整程度，有利于骨缺損的恢復；且骨碎補總黃酮的治療效果優于骨碎補的質控成分——單一黃酮類化合物柚皮苷［9］。另有研究表明，骨碎補總黃酮能夠提高大鼠顱骨骨缺損的愈合過程中血Ca、P、堿性磷酸酶（ALP）的濃度，促進缺損部位的愈合［10］，但是具體作用機制還不甚明確。有研究發現骨碎補提取物能夠促進骨髓基質細胞的成骨分化，并且促進趨化因子CXCL12的分泌［11］，提示骨碎補修復骨損傷的作用可能與其促進骨髓基質細胞趨化到損傷部位存在關聯，但骨碎補總黃酮能否促進骨髓基質細胞遷移，且該作用是否通過SDF1/CXCR4信號通路介導并不明確。

3.3AFRD可能通過SDF1/CXCR4信號通路介導ST-2細胞遷移修復骨損傷 本研究觀察了AFRD對小鼠骨髓基質細胞遷移的影響及SDF1/CXCR4信號途徑的調節，發現AFRD能夠增強ST-2細胞的遷移能力，且隨著AFRD濃度的升高作用逐漸增強，呈現劑量依賴性。同時，AFRD能夠促進ST-2細胞內SDF1和CXCR4的基因及CXCR4蛋白表達；而CXCR4抑制劑AMD3100干預后能夠抑制AFRD促進ST-2細胞遷移及上調CXCR4基因表達的作用，以上實驗證明AFRD促進ST-2細胞遷移的作用可能是通過SDF1/CXCR4信號途徑介導的。

綜上所述，基于本研究結果，筆者認為AFRD修復骨損傷的作用與其促進骨髓基質細胞遷移至骨缺損部位有關，且這一作用是通過激活SDF1/CXCR4信號途徑實現的。當然，除了促進骨髓基質細胞遷移外，AFRD修復骨損傷的作用是否還可能通過其他作用機制發揮作用，包括促進損傷部位血管新生等還有待進一步探討。