白細胞介素-4負調控NF-κB通路抑制炎癥反應的機制研究

黃潔媛，劉文明

既往研究證實，炎癥反應繼發的免疫失衡是重癥感染病理生理過程的重要特點，也是重癥感染患者病情加重的重要原因［1］。肺部嚴重感染時極易誘發急性肺損傷，這與機體免疫防御機制過度激活、促炎/抑炎反應失衡和氧化應激損傷有關［2］。因此在抗感染的基礎上，恢復促炎/抑炎反應平衡，阻斷炎癥級聯反應是急性肺損傷早期治療的關鍵。白細胞介素（interleukin，IL）-4是重要的抑炎細胞因子，由CD4+T細胞分泌，對淋巴細胞的遷移具有重要作用。既往已有研究證明，IL-4可以下調炎癥反應強度，降低嚴重感染小鼠的死亡率［3］，但是其抑炎機制目前尚未明了。髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是Toll樣受體信號通路中的重要接頭分子，可以與核因子（NF）-κB形成炎癥反應通路，導致NF-κB p65蛋白從細胞質轉入細胞核，從而誘導 IL-1、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等促炎細胞因子的轉錄和表達，放大炎癥信號。MyD88/NF-κB信號通路在感染性疾病的發生和發展中占有重要地位［4-5］。已有研究證明，IL-4可以抑制IκB激酶（IKK）的活性，進而抑制NF-κB活化。另外，IL-4對NF-κB的作用不僅局限于下游水平，對上游也會造成影響［6-7］。因此筆者推測，IL-4可能作用于MyD88/NF-κB信號通路，進而影響NF-κB活性及p65蛋白的核移位以下調炎癥反應。本研究以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）啟動小鼠巨噬細胞株Ana-1的炎癥反應，分析IL-4預處理對LPS誘導的巨噬細胞MyD88/NF-κB信號通路的影響，探討IL-4抑制炎癥的可能機制。

1 材料與方法

1.1主要材料和儀器 小鼠巨噬細胞Ana-1購自上海信裕生物科技有限公司（貨號XY-M001）；小鼠IL-4購自上海恒斐生物科技有限公司（貨號130-097-760）；DMEM培養基購自杭州仟諾生物科技有限公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司；兔抗鼠MyD88和NF-κB p65單克隆抗體購自上海生物工程有限公司；羊抗兔生物素化IgG購自北京中杉金橋公司；小鼠TNF-α和IL-6酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒購自上海哈靈生物科技公司；小鼠NF-κB p65 ELISA檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技公司；胞漿和胞核蛋白提取試劑盒購于武漢博士德有限公司。ABI 7500實時熒光定量PCR儀（ABI），半干轉印儀（Bio-Rad），垂直電泳儀（Bio-Rad），HBS-1096A酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養和構建LPS±IL-4處理Ana-1細胞模型 Ana-1巨噬細胞采用DMEM培養基培養，內含10%滅活胎牛血清、100 U/mL鏈霉素和100 mg/L青霉素，37℃，5%CO2常規細胞培養，隔日換液。當細胞貼壁融合度達到90%以上時，用0.25%胰蛋白酶進行傳代。傳代細胞接種于6孔板（1×106個/孔）。取對數生長期的Ana-1巨噬細胞，將6孔板中的Ana-1細胞分為2組：分別為LPS組（給予50μg/L LPS刺激）、LPS+IL-4組（10μg/L IL-4預培養1 h后給予LPS刺激）。在0、0.5、1和2 h時收集細胞培養上清液，用于后續實驗。

1.2.2RT-PCR檢測MyD88、NF-κB mRNA表達水平 TRIzol法提取Ana-1巨噬細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒說明將其逆轉錄為cDNA。以β-actin為內參，通過ABI 7500實時熒光定量PCR儀分別進行熒光定量PCR反應。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成并提供，序列見表1。RT-PCR反應條件為：預變性95℃30 s；95℃5 s，60℃30 s，共計40個循環。每個樣本至少重復3次。2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

Tab.1 The primer sequence of MyD88,NF-κB and actin表1 RT-PCR引物序列

1.2.3Western blot檢測MyD88和NF-κB蛋白表達水平 按照試劑盒說明書分別提取總蛋白、胞漿蛋白和胞核蛋白，BCA法進行蛋白定量。取20μL樣品加入5×SDS緩沖液，煮沸5 min使蛋白變性。經十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，孵育一抗（兔抗鼠MyD88或NF-κB p65單克隆抗體，1∶1 000），4 ℃過夜，棄去一抗，TBST洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗（羊抗兔生物素化IgG，1∶1 000）2 h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min。ECL顯色，同期以β-actin作內參。顯影后通過Quantity One軟件分析各條帶，以各條帶與內參吸光度的比值表示MyD88/NF-κB p65的相對表達量。

1.2.4ELISA檢測NF-κB p65胞核/胞漿比例 按照試劑盒說明書分別提取胞漿蛋白和胞核蛋白，BCA法進行蛋白定量。按照NF-κB p65 ELISA檢測試劑盒說明書分別檢測NF-κB p65在細胞核及細胞漿中的含量，檢測時波長設置為450 nm，并計算NF-κB p65胞核/胞漿比例。

1.2.5ELISA檢測IL-6和TNF-α含量 收集各組細胞的培養液，3 000 r/min離心10 min，取上清液，按照TNF-α和IL-6 ELISA檢測試劑盒說明書進行IL-6和TNF-α含量的檢測，檢測波長設置為450 nm。

1.3統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析。符合正態分布的計量數據以均數±標準差（±s）表示，2組不同時間點間比較采用重復測量設計的方差分析，同一時間點組間比較行t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1IL-4對LPS活化的Ana-1細胞表達MyD88的影響 隨著Ana-1細胞培養時間的延長，LPS組MyD88 mRNA和蛋白表達水平均呈逐漸升高趨勢（P＜0.05）。而LPS+IL-4組MyD88 mRNA表達水平無明顯變化（P＞0.05），MyD88蛋白表達水平則呈先升高后下降趨勢（在0.5 h時最高，2 h時下降至最低）。LPS+IL-4組MyD88 mRNA和蛋白表達水平在0 h和0.5 h時與LPS組差異無統計學意義（P＞0.05），在1 h和2 h時顯著低于LPS組（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 IL-4對LPS活化的Ana-1細胞表達MyD88蛋白的影響

2.2IL-4對LPS活化的Ana-1細胞NF-κB表達的影響 隨著Ana-1細胞培養時間的延長，無論是LPS組還是LPS+IL-4組，NF-κB mRNA和蛋白表達水平均呈現明顯升高趨勢（P＜0.05）。而2組不同時間點NF-κB mRNA和蛋白表達水平比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

圖2 IL-4對LPS活化的Ana-1細胞表達NF-κB蛋白的影響

Tab.2 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of MyD88 in LPS-activated Ana-1 cells表2 IL-4對LPS活化的Ana-1細胞表達MyD88 mRNA和蛋白的影響 （n=5，±s）

Tab.2 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of MyD88 in LPS-activated Ana-1 cells表2 IL-4對LPS活化的Ana-1細胞表達MyD88 mRNA和蛋白的影響 （n=5，±s）

＊P＜0.05；a與0 h比較，b與0.5 h比較，c與1 h比較，P＜0.05

組別LPS組LPS+IL-4組t MyD88 mRNA 0 h 1.30±0.34 1.26±0.48 0.152 0.5 h 1.68±0.12 1.72±0.43 0.200 1 h 2.14±0.30a 1.52±0.21 3.786＊2 h 2.67±0.43ab 1.21±0.14 3.063＊F 10.372＊1.415 MyD88蛋白（%）0 h 7.36±0.61 7.29±1.01 0.133 0.5 h 15.37±0.44a 16.01±0.84a 1.509 1 h 17.00±0.81ab 12.64±0.32ab 11.942＊2 h 19.37±1.24abc 7.01±0.97abc 17.555＊F 117.998＊82.627＊

Tab.3 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of NF-κB in LPS-activated Ana-1 cells表3 IL-4對LPS活化的Ana-1細胞表達NF-κB mRNA和蛋白的影響 （n=5，±s）

Tab.3 Effects of IL-4 on the mRNA and protein expression of NF-κB in LPS-activated Ana-1 cells表3 IL-4對LPS活化的Ana-1細胞表達NF-κB mRNA和蛋白的影響 （n=5，±s）

＊P＜0.05；a與0 h比較，b與0.5 h比較，c與1 h比較，P＜0.05

組別LPS組LPS+IL-4組t NF-κB mRNA 0 h 0.68±0.09 0.70±0.12 0.298 0.5 h 1.34±0.09a 1.29±0.11a 0.787 1 h 1.99±0.11ab 1.87±0.20ab 1.176 2 h 2.24±0.27ab 2.12±0.33ab 0.629 F 58.106＊27.487＊NF-κB蛋白（%）0 h 2.35±0.32 2.40±0.27 0.267 0.5 h 9.31±0.28a 8.84±0.41a 2.117 1 h 15.33±0.82ab 16.29±0.52ab 2.211 2 h 20.33±0.69abc 19.32±1.07abc 1.774 F 543.807＊419.734＊

2.3NF-κB p65胞核/胞漿比例變化 隨著Ana-1細胞培養時間的延長，LPS組NF-κB p65胞核/胞漿比例呈逐漸上升的趨勢（P＜0.05）；而LPS+IL-4組呈先上升后下降的趨勢（P＜0.05）。LPS+IL-4組NF-κB p65胞核/胞漿比例在0 h和0.5 h時與LPS組差異無統計學意義（P＞0.05），在1 h和2 h時明顯低于LPS組（P＜0.05），見表4。

2.4IL-4對LPS誘導的IL-6和TNF-α水平的影響 隨著Ana-1細胞培養時間的延長，LPS組IL-6和TNF-α水平呈逐漸升高的趨勢（P＜0.05）；LPS+IL-4組則呈先升高后下降的趨勢（P＜0.05）。LPS+IL-4組IL-6和TNF-α水平在0 h和0.5 h時與LPS組差異無統計學意義（P＞0.05），在1 h和2 h時明顯低于LPS組（P＜0.05），見表5。

Tab.4 Changes of nuclear/cytoplasmic ratio of NF-κB p65表4 NF-κB p65胞核/胞漿比例變化 （n=5，±s）

Tab.4 Changes of nuclear/cytoplasmic ratio of NF-κB p65表4 NF-κB p65胞核/胞漿比例變化 （n=5，±s）

＊P＜0.05；a與0 h比較，b與0.5 h比較，c與1 h比較，P＜0.05

組別LPS組LPS+IL-4組t 0 h 0.35±0.10 0.34±0.07 0.183 0.5 h 1.21±0.09a 1.05±0.14a 2.149 1 h 1.87±0.15ab 1.06±0.30a 5.400＊2 h 2.71±0.28abc 0.49±0.11bc 16.501＊F 100.931＊13.299＊

Tab.5 Effects of IL-4 on the levels of IL-6 and TNF-α in LPS-activated Ana-1 cells表5 IL-4對LPS誘導的Ana-1細胞中IL-6和TNF-α蛋白表達水平的影響 （ng/L，n=5，±s）

Tab.5 Effects of IL-4 on the levels of IL-6 and TNF-α in LPS-activated Ana-1 cells表5 IL-4對LPS誘導的Ana-1細胞中IL-6和TNF-α蛋白表達水平的影響 （ng/L，n=5，±s）

＊P＜0.05；a與0 h比較，b與0.5 h比較，c與1 h比較，P＜0.05

組別LPS組LPS+IL-4組t IL-6 0 h 60.21±22.58 60.08±18.37 0.01 0.5 h 193.26±17.68a 189.47±24.31a 0.282 1 h 245.36±22.58ab 164.21±15.24a 6.665＊2 h 276.34±26.00ab 142.36±18.67ab 9.359＊F 56.847＊24.972＊TNF-α 0 h 47.25±8.31 46.85±6.37 0.085 0.5 h 211.64±24.80a 208.36±30.33a 0.187 1 h 298.31±40.02ab 176.34±18.64a 6.155＊2 h 381.11±21.22abc 163.24±14.08ab 19.13＊F 89.495＊39.592＊

3 討論

抗炎細胞因子IL-4主要由CD4+T細胞產生的，可以促進T淋巴細胞活性并增強巨噬細胞吞噬功能。研究表明，IL-4對B細胞、T細胞、肥大細胞和單核巨噬細胞都有免疫調節作用［8］。有研究發現，重癥肺炎患者血清中IL-4水平明顯升高，提示IL-4可能參與了機體的抗炎過程［9-10］，但其具體抗炎機制尚未明確。

本研究采用LPS刺激Ana-1細胞以激活NF-κB炎癥信號通路，結果顯示，在LPS的誘導下，小鼠炎癥反應細胞模型建立成功：MyD88和NF-κB的mRNA和蛋白表達水平均明顯升高，NF-κB p65蛋白核移位增加，同時上調了細胞中IL-6和TNF-α的表達，這與以往文獻報道的LPS誘導發生的炎癥反應表現一致［11-12］。Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號通路是LPS胞內信號轉導的關鍵途徑。LPS通過與TLR4結合，從而誘導TLR4聚合使得信號轉導至胞內，胞內TIR區與MyD88的羧基端結合，同時MyD88通過氨基端的死亡域與白細胞介素1受體相關激酶（IRAK）的死亡結構域結合，激活IRAK的自身磷酸化，獲得游離的IRAK繼而激活腫瘤壞死因子受體相關因子-6（TRAF-6），TRAF-6激活NF-κB二聚體的抑制蛋白家族（IκB）激酶（IKKs）。IκB由于磷酸化、泛素化后降解，使得NF-κB從靜息狀態下受IκB結合處于的抑制狀態解除，進而導致NF-κB p65轉入細胞核中誘導基因轉錄，啟動IL-6、TNF-α等促炎細胞因子基因的表達［13-15］。

Lai等［16］研究顯示，IL-4可通過抑制炎癥細胞因子的基因轉錄，影響其mRNA的穩定性，進而下調炎癥細胞因子的表達。本研究通過加入IL-4進行干預LPS誘導的炎癥反應細胞模型，結果顯示，在IL-4干預下，MyD88的mRNA和蛋白表達水平呈先升高后下降的趨勢，提示LPS誘導下NF-κB激活導致p65入核增加，使得NF-κB p65胞核/胞漿比例增高；在IL-4的干擾下，進入胞核的p65蛋白減小，活化受到抑制，從而導致NF-κB p65胞核/胞漿比例的下調。

此外，本研究結果顯示，在IL-4的干擾下，促炎細胞因子IL-6和TNF-α表達水平也隨之出現逆轉。而IL-4作用下的TLR4/NF-κB信號通路中只有MyD88發生顯著變化，提示IL-4可能通過抑制MyD88而下調NF-κB活性，從而影響IL-6和TNF-α的表達，抑制LPS啟動的炎癥反應。MyD88作為TLR4/NF-κB信號通路中的關鍵接頭分子，已有研究表明在MyD88基因敲除小鼠中，LPS并不能使血清中IL-6和TNF-α水平增加［17］，提示MyD88在LPS誘導產生炎癥反應中發揮著重要作用，而本研究結果進一步提示IL-4可能作用于MyD88而參與抗炎反應。

綜上，本研究通過構建IL-4干擾的LPS誘導炎癥反應細胞模型，發現IL-4可以逆轉由于LPS誘導的促炎細胞因子IL-6和TNF-α的表達上調，可能具有抗炎作用。此外通過檢測MyD88/NF-κB信號通路中MyD88和NF-κB的表達和NF-κB p65的核移位，發現IL-4參與的抗炎機制可能與該通路中MyD88的表達下調及NF-κB p65蛋白的核移位有關。但其具體機制還需要進一步研究。