高磷通過SET8調控p53/Bcl-2/Caspase信號通路促進血管平滑肌細胞鈣化

張東雪，路靜

心血管疾病發病率逐年增加，血管鈣化是導致心血管疾病發病率增加的關鍵環節［1］。Wang等［2］研究發現引起血管鈣化的諸多因素中，高磷血癥為始動因素，高磷可誘導血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）發生表型轉化和凋亡，進而導致血管鈣化的發生。尋找高磷因素誘導的血管鈣化的機制，對于臨床診治有重要價值。組蛋白賴氨酸甲基轉移酶SET8是現今發現的唯一能夠特異性催化組蛋白H4第20位的賴氨酸甲基轉移酶（H4K20），可甲基化p53、TWIST等非組蛋白，參與調控細胞增殖、凋亡及轉分化等［3］?，FSET8在血管鈣化中的作用研究較少，且機制不明確。本研究旨在以大鼠VSMCs為研究對象，探討SET8在高磷誘導VSMCs鈣化中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗試劑及儀器 胎牛血清和DMEM培養基購自美國GIBCO公司；反轉錄試劑盒和增強型ECL試劑盒購自美國Therom公司；SET8-短發夾RNA（shRNA）質粒購自廣州復能基因有限公司；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；PI/Annexin V凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；鼠單克隆抗體SET8、p53和兔單克隆抗體Bax、Caspase3與兔多克隆抗體Bcl-2均購自英國Abcam公司；兔單克隆抗體GAPDH購自美國Bioworld公司；兔二抗與鼠二抗購自美國KPL公司。細胞培養箱、RT-PCR儀和蛋白電泳儀購自美國Therom公司，凝膠成像儀購自美國Proteinsimple公司，倒置熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2實驗模型的制備與分組 選取6只清潔級SD大鼠，均為健康雄性，購自河北醫科大學動物實驗中心（證書號：1305090）。取大鼠胸主動脈，剝離棄去血管內外膜，取中膜，將其剪成1 mm×1 mm×1 mm小塊，細胞培養瓶底均勻鋪開，使用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養細胞至第3～4代時接種于6孔板中，細胞融合度達70%～80%進行干預。為了探究高磷誘導的VSMCs中SET8及細胞凋亡情況，將VSMCs隨機分為正常組和高磷組（10 mmol/L β-甘油磷酸），培養4 d，采用茜素紅染色檢測細胞內鈣鹽沉積，采用甲基麝香草酚藍比色法檢測鈣含量，采用流式細胞學檢測細胞凋亡情況，采用Western blot和PCR檢測細胞內SET8、p53、Bcl-2、Bax、Caspase3的蛋白和mRNA的表達。為了探究SET8對細胞凋亡的調控作用，將VSMCs隨機分為3組，對照組、空質粒組（NS-shRNA）和SET8-shRNA組，SET8-shRNA組采用靶向敲低SET8基因的shRNA質粒（濃度為2μg/L）轉染VSMCs。轉染48 h，提取細胞蛋白和mRNA，采用Western blot和PCR檢測細胞內p53、Bcl-2、Bax、Caspase3的蛋白和mRNA的表達水平。

1.3茜素紅染色 將VSMCs以5×104/孔接種于兩個12孔板中，當細胞融合率達70%～80%，一個12孔板給予10 mmol/L β-甘油磷酸刺激，另一個12孔板給予轉染刺激培養4 d后，用茜素紅染液（pH=8.4，質量濃度為0.1%）對細胞進行鈣化染色，置于37℃溫箱中放置30 min，于倒置熒光顯微鏡下觀察鈣結節染色情況（鈣鹽沉積為橘紅色）并照相。

1.4鈣含量測定 取第3代VSMCs以5×104/孔密度接種于兩個12孔板中，一個12孔板給予10 mmol/L β-甘油磷酸刺激，另一個12孔板給予轉染刺激，細胞刺激4 d后棄上清液，用稀鹽酸脫鈣24 h，測定上清液中的鈣含量，并將脫鈣后的細胞用0.1%的SDS與0.1 mol/L NaOH的混合液溶解30 min，測定VSMCs中蛋白質的含量，結果用細胞鈣含量與蛋白質含量的比值表示。實驗均重復3次。

1.5流式細胞術檢測細胞的凋亡 細胞接種于6孔板中，給予高磷刺激，4 d后用冷PBS液洗2遍，根據試劑說明書進行PI/Annexin V雙重染色，應用流式細胞儀檢測細胞的凋亡率。經PI/Annexin V雙重染色后可根據不同區域區分細胞：左下象限PI和Annexin V均為陰性，為活細胞；左上象限PI為陽性、Annexin V為陰性，為死亡細胞；右下象限PI為陰性、Annexin V為陽性，為早期凋亡細胞；右上象限PI為陽性、Annexin V為陽性，為晚期凋亡細胞。實驗重復3次。

1.6RT-PCR檢測凋亡相關基因的表達 收集各組細胞提取mRNA后逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，RT-PCR檢測SET8、p53、Bcl-2、Bax、Caspase3的表達，以GAPDH 作為內參照。引物序列見表1。反應條件為：預變性95℃5 min；變性95℃ 30 s，退火55℃30 s，延伸72℃ 40 s，循環35次；終末延伸72℃10 min。將產物電泳，收集圖像并分析。實驗重復3次。

1.7Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達情況 收集各組細胞提取蛋白，配制10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，取50μg蛋白進行上樣，恒壓95 V電泳1.5 h。之后選取PVDF膜進行轉膜，恒流200 mA轉膜1 h，應用TBST洗膜3次，5%脫脂牛奶封閉1 h。加入一抗稀釋液中（SET8 1∶500，p53 1∶1 000，Caspase3 1∶2 000，Bcl-2 1∶1 000，Bax 1∶2 000，GAPDH 1∶5 000），4℃孵育過夜，洗膜，放入二抗（稀釋比例1∶5 000）稀釋液中，37℃孵育1 h，洗膜后拍照。實驗重復3次。

1.8統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學處理。計量資料呈正態分布的以均數±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

Tab.1 Primer sequence of each purpose gene表1 各目的基因引物序列

2 結果

2.1高磷對VSMCs鈣化的影響 茜素紅染色及鈣含量測定結果均顯示，高磷組鈣鹽沉積較正常組顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 The expression of calcification in each group of VSMCs圖1 各組VSMCs鈣化的表達情況

2.2高磷對VSMCs凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，高磷組細胞凋亡率明顯高于正常組（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Results of apoptosis in each group of VSMCs圖2 各組VSMCs凋亡結果

2.3高磷對VSMCs凋亡相關指標表達的影響 與正常組比較，高磷組SET8、Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量明顯降低，p53、Bax、Caspase3 mRNA和蛋白相對表達量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

2.4干擾SET8對VSMCs鈣化的影響 茜素紅染色與鈣含量測定結果均顯示，與對照組和空質粒組比較，SET8-shRNA組鈣鹽沉積顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

2.5干擾SET8基因后對凋亡相關指標表達的影響 與對照組和空質粒組比較，SET8-shRNA組Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量明顯降低，p53、Bax、Caspase3 mRNA和蛋白相對表達量明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5。

3 討論

血管鈣化是心血管疾病死亡率增高的獨立危險因素［4］。血管鈣化是由細胞介導的且高度可調的過程，其重要機制有細胞的凋亡、自噬、表型轉化等［5］。而VSMCs凋亡是血管鈣化發生的重要機制之一［6］。大量研究發現，高磷可誘導VSMCs發生凋亡，是血管鈣化重要的危險因素之一［7-8］。因此，尋找高磷因素誘導的血管鈣化的機制，對于臨床診治有重要價值。

研究表明高磷可促進VSMCs轉分化，進而誘導細胞凋亡［9］。本研究發現，給予高磷刺激后，橘紅色鈣結節明顯增多，鈣含量也明顯增多，表明高磷促進血管鈣化的發生。流式細胞儀檢測結果提示，高磷組細胞凋亡率明顯升高，提示高磷誘導VSMCs發生了凋亡。高磷組Bcl-2 mRNA和蛋白相對表達量明顯降低，p53、Bax、Caspase3 mRNA和蛋白相對表達量明顯升高，顯示高磷通過調控p53信號通路，抑制Bcl-2表達，促進Bax、Caspase3的表達，進而參與調控VSMCs的鈣化。高磷組SET8表達水平降低，提示SET8可能參與了高磷導致的血管鈣化。

Fig.3 The expressions of mRNA and protein in each group of VSMCs圖3 各組VSMCs mRNA和蛋白的表達

Fig.4 Effects of interfering SET8 on calcification of VSMCs圖4 干擾SET8對VSMCs鈣化的影響

Fig.5 The expression levels of mRNA and protein of p53,Bcl-2,Bax and Caspaste3 in each group of VSMCs圖5 各組VSMCs p53、Bcl-2、Bax、Caspase3mRNA和蛋白的表達

SET8是唯一能夠特異性催化H4K20單甲基化的賴氨酸甲基轉移酶，同時也可甲基化p53、TWIST、Wnt等非組蛋白，并參與細胞轉移、增殖、凋亡等多種生物學過程［10］。有研究顯示干擾SET8表達可導致腫瘤細胞和血管平滑肌細胞轉分化及凋亡［11-12］。抑癌基因p53是SET8最重要的非組蛋白底物，能夠調控細胞周期和細胞凋亡［13］。SET8可以特異性單甲基化p53的382賴氨酸位點（p53K382me1），抑制p53靶基因轉錄，從而抑制細胞凋亡和細胞周期阻滯［14］。Bcl-2和Bax是正負凋亡調節因子，Bcl-2起抗凋亡作用，Bax起促進凋亡作用。Bax的啟動子中存在p53的結合位點，p53能促進Bax的表達，而導致細胞凋亡［15］。Bcl-2能夠抑制Caspase3的活性，而減少細胞凋亡，進而抑制血管鈣化［16］。本研究結果顯示，干擾 SET8后 Bcl-2表達下調，p53、Bax、Caspase3表達上調，提示高磷可能通過下調SET8表達，調控p53/Bcl-2/caspase信號通路，下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達，上調促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表達，從而參與調控VSMCs的鈣化和凋亡。