CDK5介導的PPARγ磷酸化在動脈粥樣硬化泡沫細胞形成過程中的作用

沈娜，賀晶，邸研博，劉勇，田鳳石，劉運德

動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是心血管疾病的病理基礎，單核/巨噬細胞在其發生發展過程中發揮重要作用。單核/巨噬細胞泡沫化是AS發生發展的標志，細胞內脂質聚積，膽固醇外流減少，促進了泡沫細胞形成［1］。過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）屬于核受體超家族中一員，在糖尿病、肥胖和心血管疾病等代謝性疾病中都具有重要意義，PPARγ除了高表達于脂肪組織外，還可表達于血管及動脈粥樣斑塊中的單核/巨噬細胞內［2］。研究顯示，PPARγ可通過調節巨噬細胞清道夫受體CD36、清道夫受體A1（Scavenger receptor A1，SR-A1）和膽固醇外流基因三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ATP binding cassette transporter A1，ABCA1）、三磷酸腺苷結合盒轉運體G1（ATP binding cassette transporter G1，ABCG1）影響泡沫細胞形成［3-4］，但其機制尚待明確。細胞周期素依賴蛋白激酶5（Cyclin-dependent kinase 5，CDK5）持續激活可使PPARγ磷酸化，進而導致肥胖相關的脂代謝異常［5］，而此作用是否參與AS形成過程中單核/巨噬細胞內脂質變化仍不清楚。本研究旨在通過觀察CDK5介導的PPARγ磷酸化對泡沫細胞形成的影響，探討CDK5/pPPARγ途徑在AS中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1實驗材料 小鼠Raw264.7巨噬細胞購自中國科學院上海細胞庫；DMEM培養基、標準胎牛血清、胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；氧化低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）購自廣州奕元生物技術有限公司；Roscovitine（一種CDK抑制劑）、油紅O、BCA蛋白定量檢測試劑盒購自美國Sigma公司；總膽固醇和游離膽固醇測定試劑盒購自北京普利萊基因技術有限公司；兔抗pPPARγ購自北京博奧森生物技術有限公司；兔抗tPPARγ、p35、CDK5及鼠抗β-actin均購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠IgG購自北京索萊寶公司；總RNA提取試劑盒購自美國Qiagen公司、反轉錄PCR（Reverse transcription PCR，RT-PCR）試劑盒購自日本Takara公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；二氧化碳培養箱、紫外分光光度計均購自美國Thermo Fisher公司；酶標儀購自瑞士Tecan公司；PCR儀、電泳轉印系統、凝膠成像分析儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養與分組 用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養Raw264.7巨噬細胞，待細胞生長至對數期，消化細胞為單個細胞，鋪于6孔板中，每孔5×105個細胞。將細胞分為3組（每組3個復孔），即對照組（C組）、ox-LDL組（50 mg/L ox-LDL，O 組）、Roscovitine+ox-LDL組（15μmol/L Roscovitine+50 mg/L ox-LDL，R組）。待細胞融合至70%左右，R組加入15μmol/L Roscovitine預處理30 min，之后O組和R組分別加入50 mg/L ox-LDL繼續培養24 h，使其轉化為泡沫細胞；C組不作處理。

1.2.2Western blot檢測pPPARγ、tPPARγ、p35和CDK5蛋白的表達 每孔收集1×106個細胞，加入適量裂解液裂解，BCA法測定各組蛋白含量；將處理好的樣品以30μg/孔加到SDSPAGE膠孔中，恒壓80 V電泳，當Marker開始分離時，將電壓調至120 V，濕轉法恒壓90 V冰浴轉膜1 h，室溫封閉1 h，一抗（兔抗pPPARγ，1∶1 000；兔抗tPPARγ，1∶1 000；兔抗p35，1∶1 000；兔抗CDK5，1∶2 000；鼠抗β-actin，1∶10 000）4 ℃過夜，二抗（1∶10 000）室溫孵育45 min，ECL法顯影，顯色后置于凝膠成像儀中成像，采用β-actin作為內參，利用Image Lab軟件對各組蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.2.3油紅O染色 使用油紅O對C組、O組、R組轉化成熟的Raw264.7細胞進行染色，吸凈培養基，PBS洗1次；4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗3次；每孔加1 mL油紅O工作液，37℃孵育30 min，棄去油紅O，PBS洗3次，于顯微鏡下觀察各組細胞染色情況并拍照。隨后每孔加入200μL異丙醇抽提油紅O，使用紫外分光光度計測定358 nm處OD值。

1.2.4細胞內膽固醇含量的檢測 收集3組分化成熟的Raw264.7細胞，分別加入150μL裂解液，混勻后，靜置10 min，室溫2 000×g，離心5 min，取上清液備用。BCA法對各組蛋白進行定量檢測，剩余樣品用于檢測細胞總膽固醇（TC）、游離膽固醇（FC）、膽固醇酯（CE）含量并計算CE/TC，CE/TC＞0.5表明泡沫細胞轉化成功。取190μL工作液加到96孔板中，之后分別加入標準品、待測樣品各10μL，37℃孵育20 min，于酶標儀檢測各孔OD值，繪制標準曲線并計算濃度，以每毫克蛋白濃度校正膽固醇含量。

1.2.5RT-PCR檢測攝取相關基因CD36、SR-A1和外流相關基因ABCA1、ABCG1的表達 細胞誘導成熟后，按照試劑盒說明書提取各組總RNA，并反轉錄為cDNA，按以下體系進行PCR反應：總體積25μL，10×Taq buffer 2.5μL，dNTP mix 2.5μL，上下游引物各1μL，cDNA模板1μL，RNase-free water補足至25μL。反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35個循環；72℃延伸7 min，最后4℃維持。反應結束后，將產物進行瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀中成像，采用β-actin作為內參，利用Image Lab軟件對各組條帶的灰度值進行分析，見表1。

Tab.1 Primers for RT-PCR表1 RT-PCR引物

1.3統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行分析，符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1CDK5介導的PPARγ磷酸化在ox-LDL誘導的Raw264.7巨噬細胞中的作用 Western blot結果顯示，ox-LDL誘導后，O組pPPARγ/tPPARγ和p35/CDK5比值較C組明顯升高；加入CDK5抑制劑后，R組pPPARγ/tPPARγ和p35/CDK5比值較O組顯著降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1、表2。

Fig.1 Role of CDK5-mediated PPARγ phosphorylation in ox-LDL-induced Raw264.7 macrophages圖1 CDK5介導的PPARγ磷酸化在ox-LDL誘導的Raw264.7巨噬細胞中的作用

Tab.2 Role of CDK5-mediated PPARγ phosphorylation in ox-LDL-induced Raw264.7 macrophages表2 CDK5介導的PPARγ磷酸化在ox-LDL誘導的Raw264.7巨噬細胞中的作用 （n=3，±s）

Tab.2 Role of CDK5-mediated PPARγ phosphorylation in ox-LDL-induced Raw264.7 macrophages表2 CDK5介導的PPARγ磷酸化在ox-LDL誘導的Raw264.7巨噬細胞中的作用 （n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與O組比較，P＜0.05

組別pPPARγ/tPPARγp35/CDK5 C組O組R組F 0.30±011 0.52±0.10a 0.24±0.10b 6.206＊0.49±0.07 1.06±0.21a 0.64±0.13b 11.731＊＊

2.2泡沫細胞形成情況 油紅O染色結果顯示，O組脂質聚積較C組明顯增多（OD值：0.37±0.05vs.0.21±0.02），R組脂質聚積較O組減輕（0.25±0.03vs.0.37±0.05），差異均有統計學意義（n=3，F=21.237，P＜0.01），見圖2。細胞內膽固醇含量檢測結果顯示，O組TC、FC、CE和CE/TC比值較C組升高，R組TC、FC、CE和CE/TC比值較O組降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。

Fig.2 Effects of CDK5 inhibitor on lipid accumulation in ox-LDL-induced Raw264.7 macrophages(Oil red O staining,×400)圖2 CDK5抑制劑對ox-LDL誘導的Raw264.7巨噬細胞脂質聚積的影響（油紅O染色，×400）

Tab.3 Differences of cholesterol content in Raw264.7 macrophages表3 Raw264.7巨噬細胞內膽固醇含量的變化（n=8，±s）

Tab.3 Differences of cholesterol content in Raw264.7 macrophages表3 Raw264.7巨噬細胞內膽固醇含量的變化（n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與C組比較，b與O組比較，P＜0.05

組別C組O組R組F TC（mg/g）19.82±3.95 62.18±7.03a 35.29±5.54b 115.214＊＊FC（mg/g）15.56±2.92 28.74±4.75a 19.84±3.42b 25.318＊＊CE（mg/g）4.26±1.25 33.44±3.07a 15.45±3.07b 254.769＊＊CE/TC 0.21±0.04 0.54±0.04a 0.44±0.05b 124.118＊＊

2.3脂質代謝相關基因的mRNA的水平 與C組相比，O組ox-LDL攝取相關基因CD36和SR-A1的mRNA表達水平升高，而膽固醇外流相關基因ABCA1和ABCG1的mRNA表達水平降低；加入抑制劑處理后，R組CD36和SR-A1的mRNA表達水平較O組降低，而ABCA1和ABCG1的mRNA表達水平較O組升高，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3、表4。

Fig.3 The expression levels of lipid metabolism-related genes圖3 脂質代謝相關基因的mRNA表達水平

Tab.4 Expression levels of lipid metabolism-related genes表4 脂質代謝相關基因的mRNA表達水平 （n=3，±s）

Tab.4 Expression levels of lipid metabolism-related genes表4 脂質代謝相關基因的mRNA表達水平 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與C組比較，b與O組比較，P＜0.05

組別C組O組R組F攝取相關基因CD36 0.29±0.08 0.58±0.12a 0.32±0.09b 7.176＊SR-A1 0.26±0.11 0.68±0.20a 0.35±0.13b 6.012＊外流相關基因ABCA1 0.62±0.10 0.34±0.08a 0.63±0.14b 6.869＊ABCG1 0.73±0.15 0.42±0.11a 0.72±0.08b 6.786＊

3 討論

AS是一種多因素引起的脂代謝紊亂性疾病，LDL誘導的細胞內脂質聚積被認為是AS的觸發因素，LDL經氧化修飾后被巨噬細胞攝取，大量膽固醇儲存于巨噬細胞中，最終形成泡沫細胞［6］。本研究以ox-LDL誘導Raw264.7巨噬細胞，構建泡沫細胞模型，油紅O染色結果可見模型組細胞內出現大量紅染脂質顆粒，細胞內總膽固醇含量增加，且CE/TC比值＞0.5，符合泡沫細胞特點［7］，表明泡沫細胞造模成功。

PPARγ是一種配體激活型轉錄因子，可調控肥胖、脂代謝紊亂、糖尿病、胰島素抵抗等多種與AS發生相關的危險因素［8］，其功能紊亂可導致血管病變，例如 AS和高血壓［9］。CDK5是 PPARγ 的上游激酶［10］，存在于神經元細胞、角膜上皮細胞、單核細胞等多種類型細胞中，CDK5被p35蛋白或其剪切體p25激活后參與調節機體多種生物學功能［11］。Bai等［12］研究中指出，ApoE-/-缺陷小鼠中p25/CDK5水平明顯高于對照組，且使用CDK5抑制劑Roscovitine干預后，動脈粥樣硬化斑塊面積明顯減少，說明CDK5活性升高促進了AS的發生發展。在本課題組前期研究中證實，PPARγ激動劑替米沙坦可降低CDK5激活引起的PPARγ磷酸化，調節脂聯素等脂代謝相關基因的表達，起到改善胰島素抵抗的作用［13-14］。而CDK5介導的PPARγ磷酸化對巨噬細胞和AS的作用尚未明確。本研究觀察到ox-LDL刺激后，p35/CDK5和pPPARγ/tPPARγ水平明顯升高，CDK5抑制劑干預后，pPPARγ和p35蛋白表達均呈下降趨勢，而PPARγ和CDK5蛋白表達并無變化，提示ox-LDL可能通過某種途徑上調了p35表達，使CDK5活性升高，進而導致PPARγ磷酸化水平升高。此外，本研究還觀察到，巨噬細胞內脂質聚積和細胞內膽固醇濃度的變化與pPPARγ/tPPARγ變化一致，提示PPARγ磷酸化可能誘導了巨噬細胞內脂質代謝紊亂，最終導致泡沫細胞形成。

為了進一步探討PPARγ磷酸化影響泡沫細胞形成的機制，本研究對比了各組脂質代謝相關基因的表達。清道夫受體CD36和SR-A1在ox-LDL攝取中發揮主要作用［15］，其表達升高可促進巨噬細胞對ox-LDL攝取，使細胞內膽固醇生成增加，促進泡沫細胞形成。高脂喂養的ApoE-/-小鼠的主動脈斑塊及ox-LDL誘導的巨噬細胞內CD36和SR-A1水平均明顯上升，證實二者的存在促進了AS發生［16-17］。ATP結合盒轉運蛋白ABCA1和ABCG1是調控巨噬細胞內膽固醇流出的主要蛋白，參與膽固醇逆向轉運過程，促進巨噬細胞內游離膽固醇流至高密度脂蛋白顆粒及載脂蛋白A1，延緩AS進程［18］。ABCA1和ABCG1功能障礙或基因表達減少均可導致膽固醇外流受阻，促進AS發生。研究顯示，PPARγ激動劑降低了CD36基因的表達［19］，增高了ABCA1和ABCG1基因的表達［20］，提示 PPARγ激活對AS具有保護作用。本研究發現，在泡沫細胞形成過程中，pPPARγ/tPPARγ水平增高，CD36、SR-A1基因表達水平上升，ABCA1和ABCG1基因表達水平下降，在抑制劑影響泡沫細胞形成的過程中，CD36和SR-A1基因表達變化與pPPARγ/tPPARγ水平一致，ABCA1和ABCG1的基因表達水平與pPPARγ/tPPARγ水平呈相反趨勢，提示PPARγ磷酸化后，其轉錄活性可能降低，進而引起上述基因表達失衡，促進泡沫細胞形成。

綜上所述，CDK5激活所導致的PPARγ磷酸化可能通過調節ox-LDL攝取和膽固醇外流相關基因的表達，加重巨噬細胞內脂質聚積，促進泡沫細胞形成，加速AS進程。