T-SPOT.TB在肺結核早期抗癆治療有效過程中的變化趨勢研究

李曉非，劉紅偉，羅風，邱萬

中國為結核病高流行國家［1］，2017年全球新發結核病患者約1 000萬例，我國新發結核病患者88.9萬，結核病疫情嚴峻［2-3］?？刂品谓Y核的關鍵是探索出精準有效的結核病診斷及治療監測新方法［4-5］。但是當前臨床上尚無針對抗癆治療效果快速準確的評估手段，僅僅通過觀察患者的臨床表現及輔助檢查結果來推斷治療是否有效，特異度及敏感度均較低［6-7］。因此，探索可快速、特異、正確地反映肺結核抗癆療效的方法已迫在眉睫。結核感染T細胞斑點試驗（T-cell spot of Tuberculosis，T-SPOT.TB）是根據酶聯免疫斑點法（enzyme-linked immunospot test，ELISPOT）的原理直接檢測并計數人新鮮外周血中釋放γ-干擾素的結核特異性抗原［早期分泌靶向抗原 6（earlysecreting antigen target-6，ESAT-6）、培養濾液蛋白10（culture filtrate protein-10，CFP-10）］刺激活化效應T細胞數量的方法，在結核病診斷方面有較高的價值［8-10］。有研究顯示，隨著抗癆治療進行，機體結核分枝桿菌數量降低，患者細胞免疫（抗原特異性免疫）應答狀態隨之改變，繼而可能出現結核特異性活化效應T細胞數量的不斷減少，即TSPOT.TB結果的降低，提示T-SPOT.TB有望成為監測肺結核患者早期抗癆治療效果的指標［7，11-13］。目前，國內偶有關于T-SPOT.TB監測肺結核治療效果的報道，且各家研究結果并不完全一致［6-7，14］?；谝陨蠁栴}，本研究通過分析肺結核患者抗癆治療前后T-SPOT.TB結果動態變化趨勢及機體對結核特異性抗原（ESAT-6、CFP-10）刺激免疫應答水平的變化，探討T-SPOT.TB在肺結核早期抗癆治療有效過程中的變化趨勢，以期為臨床肺結核抗癆療效評估，探索出切實有效的實驗室監測指標。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2016年6月—2019年2月在我院結核科明確診斷為初治活動性肺結核患者。納入標準：（1）符合中華人民共和國衛生行業標準-肺結核診斷（WS 288-2017）［15］。（2）依據《結核病治療指南》進行規范化抗結核治療［16-17］。（3）初診及隨訪均在我院做T-SPOT.TB檢測。（4）經規范化抗癆治療，依據臨床表現及輔助檢查判斷為治療有效者。排除標準：（1）來我院就診前已經接受過抗結核治療。（2）隨訪未成功。（3）患有艾滋病、病毒性肝炎、腫瘤等其他疾病導致機體免疫系統受影響者。依據以上標準，最終納入研究對象50例，男、女各25例，年齡17～65歲，中位年齡27歲。本研究獲昆明市第三人民醫院倫理委員會批準，并與患者簽署知情同意書。

1.2主要材料 T-SPOT.TB試劑盒、溫控水平離心機（18～25℃，離心力≥1 800×g）。RPMI-1640培養基（江蘇長星公司）、緩沖液（天津灝洋華科公司）、人外周血淋巴細胞分離液（天津灝洋華科公司）、顯微鏡（奧林巴斯CX-31）、生物安全柜（青島海爾公司）。

1.3試驗方法

1.3.1標本采集 收集患者抗結核治療前、治療后（30 d、1個月、3個月）血液標本，同時對患者歷次就診時的臨床表現做好詳細記錄。用無菌注射器抽取外周靜脈血5～8 mL至加有肝素鈉的真空采血管中，室溫（18～25℃）保存，4 h內完成外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分離。

1.3.2T-SPOT.TB操作及結果判讀 試驗操作過程及結果判讀均按照T-SPOT.TB試劑盒配套說明書嚴格執行。準確記錄每1個檢測樣本T-SPOT.TB試驗結果中ESAT-6抗原孔、CFP-10抗原孔的具體斑點數值。根據抗原ESAT-6和/或抗原CFP-10孔的反應判斷結果，陽性結果參照以下兩條標準中的任意一條：（1）空白對照孔斑點數為0～5個時：（抗原ESAT-6或抗原CFP-10孔的斑點數）-（空白對照孔斑點數）≥6。（2）空白對照孔斑點數為6～10個時：（抗原ESAT-6或抗原CFP-10孔的斑點數）≥2×（空白對照孔斑點數）。

1.4療效觀察 患者抗結核治療采取自行服藥方式，遵醫囑門診定期復查。臨床表現（如咯血、消瘦、胸痛、發熱等）持續緩解及輔助檢查提示病灶消失或鈣化等為有效病例，納入本次研究［18］；若抗癆治療后臨床表現及輔助檢查結果無明顯變化或病情加重，則視為無效病例［19］，予以剔除。

1.5質量控制 課題數據采集前，對相關專業人員分別參照《肺結核診斷標準》（WS 288-2017）、《結核病治療指南》和TSPOT.TB（免疫斑點法）操作說明書等，統一進行規范化培訓。嚴格按照納入及排除標準收集數據，信息調查留取紙質版，采用雙人雙錄方式錄入檢測數據，請專業技術人員進行TSPOT.TB試驗操作且整個操作過程均達到質量控制目標。注：《肺結核診斷標準》（WS 288-2017）未實施之前，本研究入組病例診斷標準參照《肺結核診斷標準》（WS 288-2008）。

1.6統計學方法 采用SPSS 20.0進行數據分析處理。不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，不同時間點比較采用Friedman秩和檢驗；計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1肺結核患者抗癆治療有效過程中T-SPOT.TB斑點數變化趨勢 T-SPOT.TB斑點數（ESAT-6抗原孔、CFP-10抗原孔、“ESAT-6+CFP-10”抗原孔）在初診行短程標準抗結核治療前和治療后30 d、1個月、3個月基本呈逐漸降低的趨勢（P＜0.05），見圖1、表1。

Fig.1 Trends of T-SPOT.TB results before and after treatment at 0.5,1 and 3 months圖1 治療前和治療后0.5、1、3個月T-SPOT.TB結果變化趨勢

2.2治療前及治療3個月后機體對ESAT-6、CFP-10刺激應答變化趨勢 與治療前相比，機體在治療3個月后對ESAT-6和CFP-10抗原刺激應答反應均下降。ESAT-6應答變化升高占比14.00%（7/50）、降低占比86.00%（43/50）；CFP-10應答變化升高占比4.00%（2/50）、降低占比96.00%（48/50），治療3個月后機體對ESAT-6、CFP-10應答反應變化一致（χ2=1.954，P=0.162）。

Tab.1 Comparison of T-SPOT.TB results between different time points表1 不同時間點T-SPOT.TB結果的差異性比較 ［M（P25，P75）］

3 討論

T-SPOT.TB是利用當機體T淋巴細胞再次受到具有毒力的結核分枝桿菌特異性抗原刺激后可活化為分泌結核分枝桿菌特異性γ-干擾素的效應T細胞，檢測并計數效應T細胞數量，以評估機體是否被結核分枝桿菌感染的一種手段；該試驗中的抗原在致病結核分枝桿菌RD1區上：Rv3874編碼的CFP-10抗原和Rv3875編碼的ESAT-6抗原［20-23］。有研究顯示，結核分枝桿菌抗原特異性效應T細胞一旦失去致病菌的刺激就會很快凋亡，且結核病患者若不進行任何臨床干預，其T-SPOT.TB結果不變；但隨著抗癆治療的有效進行，機體結核分枝桿菌抗原特異性細胞免疫應答水平隨之改變，效應T細胞數量會隨著機體內細菌載量的下降而下降［24-25］；說明TSPOT.TB結果可能會隨著患者抗癆治療病情好轉而不斷降低甚至轉陰，從而進一步提示T-SPOT.TB可能成為評估活動性肺結核抗癆治療效果的一個新的敏感指標［26-29］。

本次初步研究發現T-SPOT.TB斑點數在肺結核早期抗癆治療有效過程中呈下降趨勢。吳家寶等［12］對9例活動性肺結核患者也進行了4個時間點（治療前，治療后2、4、6個月）的追蹤觀察，結果發現隨著抗癆治療地有效進行，結核分枝桿菌抗原特異性淋巴細胞的數量隨著機體致病菌負荷的下降而變化。Park等［30］觀察并記錄確診的33例活動性肺結核患者抗癆治療前及治療結束時的數據，分析結果發現ESAT-6和CFP-10的平均斑點計數分別下降了27和24，指出隨著抗癆治療地有效進行，T-SPOT.TB結果明顯下降。以上研究結果均與本研究結果相似。Wang等［29］對13例正在抗癆治療的肺外結核患者進行了連續T-SPOT.TB檢測，發現在抗癆治療6個月后，ESAT-6和CFP-10抗原孔斑點數無明顯下降（P=0.191，P=0.061）。汪鍇等［24］對62例脊柱結核患者進行了5個時間點（抗癆治療前、1、3、6和12個月）的追蹤隨訪，結果發現在后4個時間點統計TSPOT.TB結果轉陰人數/臨床癥狀緩解人數比值分別為0、8.3%、22.0%和51.3%，提示該試驗不可用于評估脊柱結核療效。以上研究結果與本研究結果不一致，考慮原因可能為：（1）入組樣本量均較少。（2）研究追蹤隨訪時間不同。（3）研究結核感染部位及病種差異。（4）研究人群的地域及遺傳背景差異。（5）采用T-SPOT.TB判斷疾病預后的視角不同等。

本研究還發現，經過3個月治療，機體對ESAT-6、CFP-10刺激應答水平變化一致。何紫琪等［6］對113例結核病患者治療前、后CFP-10和ESAT-6應答變化趨勢分析發現，治療前、后機體對CFP-10和ESAT-6抗原應答變化有差異，結核病治療的有效監測手段是CFP-10的定量應答，與本研究結果存在差異。Ewer等［31］對38例結核菌素皮膚試驗陽性者進行研究發現，其接受3個月預防性抗癆治療后，RD1區特異性T細胞反應顯著下降，其中16%的患者在隨訪期間出現RD1區特異性T細胞反應呈陰性，該現象可能反映了預防性抗癆治療期間活桿菌數量的減少，此研究與本研究結果基本相符。Aiken等［32］研究發現，抗癆治療1年后，機體對CFP-10和ESAT-6刺激的應答反應降低，伴隨著結核病的成功治療，結核分枝桿菌特異性抗原斑點計數顯著下降，提示ELISPOT試驗具有成為衡量結核病治療效果的潛力。目前關于肺結核患者抗癆治療過程中機體對ESAT-6、CFP-10刺激應答水平變化的研究略少，考慮到此研究現狀，分析各研究結果差異的原因可能是：（1）不同學者對研究對象的追蹤觀察時間點各不相同。（2）不同患者由于遺傳背景不同，個體存在較大差異。（3）不同科研團隊檢測技術水平差異。（4）樣本量差異導致結果偏移。（5）研究對象的入組標準、病種及分組差異等。

目前T-SPOT.TB試驗已在世界各地許多實驗室得到廣泛應用，關于探索T-SPOT.TB是否能成為肺結核療效監測有效指標方面仍存在爭議，不同研究從不同的視角出發，探索出其監測結核病療效的結論也存在較大差異。本研究從探索T-SPOT.TB斑點計數在肺結核早期抗癆治療有效過程中的變化趨勢這一視角出發，得出T-SPOT.TB斑點數在肺結核早期抗癆治療有效過程中呈下降趨勢；治療前與抗癆治療有效后（第3個月時）機體對ESAT-6、CFP-10刺激應答水平變化一致的結論。本研究為探索TSPOT.TB是否能成為肺結核抗癆療效監測的良好指標進行了初步嘗試。但由于本研究的標本量較少、追蹤觀察時間略短、入組人群缺少治療失敗或治療期間病情反復的患者等不足，可能會使研究結果產生偏倚，未來仍需更全面、大樣本（尤其是抗癆治療無效結核病患者）、多中心的前瞻性病例對照研究，為探索T-SPOT.TB是否能成為肺結核療效監測的良好指標提供更全面的數據支持。