實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷大鼠Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)基因NQO1、GCLC和GCLM表達(dá)的變化

胡躍強(qiáng)，唐 農(nóng)，王啟芝，李媛媛，廖泰榮，秦紅玲

氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)是腦缺血缺氧后引起大腦神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素之一[1,2]。抑制OS反應(yīng)，是減輕腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷的重要途徑。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸醌氧化還原酶1(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate quinine oxidoreductase,NQO1)是人體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝酶，谷氨酰半胱氨酸連接酶(Glutamatecysteine ligase，GCL)是還原型谷胱甘肽(Glutathione tablets,GSH)的合成限速酶，其催化亞基GCLC和調(diào)節(jié)亞基GCLM是非常重要的抗氧化蛋白酶，對(duì)抗氧化應(yīng)激能力的提高有重要作用。NQO1、GCLC和GCLM三者均為核轉(zhuǎn)錄因子-E2 相關(guān)因子2(NF-E2-related factor 2,Nrf2) 細(xì)胞抗OS反應(yīng)信號(hào)重要調(diào)控通路的下游因子[3～6]，在腦I/R損傷中鮮有研究。本文我們探討了大鼠腦缺血再灌注后缺血半暗帶Nrf2/ARE信號(hào)通路相關(guān)蛋白NQO1、GCLC和GCLM的表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，以闡明腦缺血后三者和腦缺血損傷的關(guān)系。

1 材 料

1.1 分組及處理 健康雄性SPF級(jí)SD大鼠80只，體重(250±50)g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。隨機(jī)將大鼠分為兩組：假手術(shù)組(sham-operation，SO)、模型組(MCAO)，每組40只。每組按照再灌注后12 h、1 d、2 d、3 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均分為4個(gè)亞組(n=10)。分別作如下處理：假手術(shù)組(SO 組)：以假手術(shù)代替缺血再灌注，線(xiàn)栓只插入頸內(nèi)動(dòng)脈9 mm，然后正常飼養(yǎng)，自由飲水；MCAO組：動(dòng)物行MCAO 2 h，再灌注后12 h、1 d、2 d、3 d處死。

1.2 主要試劑 還原型谷胱甘肽(GSH)檢測(cè)試劑盒 (上海酶聯(lián)生物)；活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗鼠NQO1多克隆抗體和兔抗鼠GCLC、GCLM單克隆抗體(Abcam公司)；偶聯(lián)有辣根過(guò)氧化物(HRP)羊抗兔 IgG二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；總RNA 提取試劑盒(TIANGEN公司)；PCR反應(yīng)試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Trizol reagent(Takara公司)；引物及內(nèi)參均由桂林恒順公司提供。

1.3 動(dòng)物模型制備 采用大鼠大腦中動(dòng)脈梗阻模型，參照Longa的線(xiàn)栓法進(jìn)行，頸正中線(xiàn)切口3 cm～4 cm，鈍性分離，暴露右側(cè)胸鎖乳突肌和胸骨舌骨肌之間的三角區(qū)域，沿胸鎖乳突肌內(nèi)側(cè)分離肌肉筋膜，暴露頸總動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈的近心端和遠(yuǎn)心端分別穿線(xiàn)(4-0號(hào)，硅膠包被的圓頭尼龍線(xiàn)栓)，近心端系緊，距此節(jié)1 cm處的遠(yuǎn)心端系一松節(jié)備用，在頸總動(dòng)脈近頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處以微動(dòng)脈夾暫時(shí)夾閉，在頸總動(dòng)脈的兩線(xiàn)間，距頸總動(dòng)脈分叉處5 mm左右，剪一斜行45°小口，松開(kāi)分叉處動(dòng)脈夾進(jìn)行插線(xiàn)，在栓線(xiàn)標(biāo)記接近頸總動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處或遇阻力感時(shí)停止。在大鼠造模麻醉清醒后1 h灌胃，2 h后再灌注，規(guī)定時(shí)間點(diǎn)處死。

2 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法

2.1 氧化應(yīng)激水平檢測(cè) 取再灌注后12 h、1 d、2 d、3 d每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各10只大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)腦組織約50 mg，置于玻璃勻漿器中勻漿，1000×g離心10 min，取上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)ROS水平和GSH活性。

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)NQO1、GCLC和GCLM mRNA 既定的時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，參照文獻(xiàn)方法立即分離同側(cè)大腦的頂葉皮質(zhì)約50 mg，該區(qū)域被認(rèn)為缺血半暗帶區(qū)或邊緣區(qū)。按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總mRNA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。提取大腦組織總RNA參考Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取。(1)提取大腦組織mRNA：參考Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總mRNA。(2)引物序列：NQO1：上游：5’- ACCTTGCTTTCCATCACCAC-3’；下游：5’-AAGACC TGGAAGCCACAGAA-3’；GCLC：上游：5’- AACAAGAAACATCCGGCATC-3’；下游：5’- TTTGATGCCTCCTCATCCTC-3’；GCLM：上游：5’-AATCTTGCCTTCCT TCCCATTG-3’；5’-GGCTTCAATGTCAGGGATGCTTTC-3’；β-actin：上游：5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’；下游：5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’。(3)反應(yīng)體系及條件：反應(yīng)體系均為10 μl，其中 SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5 μl，cDNA 模板1.0 μl、上下游引物(10 pmol/μl)各0.4 μl、探針(10 pmol/μl)各0.4 μl，加無(wú)RNA 酶的水至3.2 μl，在DNA Engine Opticon TM 2連續(xù)熒光檢測(cè)系統(tǒng)(MJ Research公司)中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。(4)反應(yīng)條件為： 94 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃，30 s，55 ℃ 20 s 40個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。每例樣品及陰性對(duì)照均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，取均值；(5)結(jié)果處理：ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測(cè)樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本)；B=CT(目的基因，對(duì)照樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本);K=A-B，表達(dá)倍數(shù)=2-K。ΔCT值與mRNA表達(dá)量成反比，即ΔCT值越小，表明mRNA表達(dá)量越多。

2.3 Western blot檢測(cè)NQO1、GCLC和GCLM蛋白表達(dá) 參照前法取大腦的頂葉皮質(zhì)約50 mg，作以下處理：(1)收集蛋白樣品：使用細(xì)胞裂解液對(duì)缺血半暗帶組織(100 mg)樣品進(jìn)行裂解，然后測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度； (2)電泳：在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,100 ℃變性3 min，冷卻到室溫后，把蛋白樣品(20 μg)直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)垂直電泳進(jìn)行分離(120 V)；(3)PVDF轉(zhuǎn)膜：使用Bio-Rad轉(zhuǎn)膜裝置，轉(zhuǎn)膜電流為300 mA，時(shí)間為60 min；(4)封閉：轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的Western洗滌液中，漂洗2 min，5%BSA37 ℃封閉60 min；(5)一抗孵育：立即加入稀釋好的NQO1、GCLC和GCLM一抗(1∶50)，4 ℃孵育過(guò)夜；(6)二抗孵育：二抗稀釋液稀釋辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶100),室溫孵育60 min；(7)蛋白檢測(cè)：超敏ECL發(fā)光液來(lái)檢測(cè)蛋白，置于X-感光盒于暗室內(nèi)曝光；(8)結(jié)果處理：采用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，獲取各組Western blot 條帶的平均光密度(OD)值，內(nèi)參為β-actin，目的蛋白與內(nèi)參光密度比值即為目的蛋白的相對(duì)值。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理，成組設(shè)計(jì)多樣本均數(shù)的比較用單因素方差分析，多樣本均數(shù)與同組均數(shù)間的比較用LDS-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 各組ROS水平和GSH活力的比較 與SO組比較，MCAO組腦組織中GSH活力顯著降低，ROS活性顯著升高(P<0.05或P<0.01)(見(jiàn)表1、表2)。

3.2 各組NQO1及GCLC和GCLM mRNA表達(dá)的變化 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，SO組有少量NQO1、GCLC及GCLM mRNA表達(dá)；MCAO組大鼠腦缺血再灌注缺血半暗帶三者表達(dá)1 d到達(dá)高峰(P<0.05或P<0.01)，隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸下降，但3 d時(shí)仍保持較高表達(dá)水平(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

3.3 各組NQO1、GCLC及GCLM蛋白表達(dá)的變化 Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，SO組三者均可檢測(cè)到較弱的蛋白表達(dá)，MCAO 組大鼠腦缺血再灌注12 h 缺血半暗帶三者蛋白表達(dá)開(kāi)始升高，24 h表達(dá)達(dá)高峰(P<0.01)，隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)逐漸下降，3 d后但仍保持較高表達(dá)水平(P<0.05) (見(jiàn)表4、圖1)。

表1 各組大鼠ROS水平比較

與SO組比較*P<0.01

表2 各組大鼠GSH比較

與SO組比較*P<0.01

表3 各組大鼠NQO1、GCLC及GCLM mRNA表達(dá)的變化

與SO組比較*P<0.05,#P<0.01

表4 各組大鼠NQO1、GCLC及GCLM蛋白表達(dá)的變化

與SO組比較*P<0.05，#P<0.01

注：1～5道分別代表SO組和MCAO組12 h、24 h、2 d、3 d

圖1 NQO1、GCLC及GCLM蛋白表達(dá)的Western blot圖

4 討 論

腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞損傷，從而引起其氧化磷酸化的能力大大下降，進(jìn)而使ATP的合成減少，最終導(dǎo)致體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)蓄積，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。NQO1屬于黃素酶，是人體Ⅱ相抗氧化酶和重要的抗氧化物質(zhì)。它以NADPH為受體，催化包括ROS、輔酶Q在內(nèi)的還原反應(yīng)。在該酶的作用下，醌類(lèi)在體內(nèi)直接被還原成氫醌，減少了醌類(lèi)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的氧自由基，從而對(duì)醌類(lèi)物質(zhì)代謝引起氧化應(yīng)激損傷形成一種保護(hù)機(jī)制[7]，進(jìn)而維持細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體等細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。NQO1的表達(dá)受到Nrf2/ARE通路的調(diào)控，其表達(dá)量與Nrf2的表達(dá)有關(guān)[8]，在Nrf2敲除小鼠中它的表達(dá)明顯減少[9]。

還原型谷胱甘肽(Glutathione tablets,GSH)是神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的重要還原性物質(zhì)，具有清除自由基、穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜等作用，是體內(nèi)重要的抗氧化劑。GCL是GSH合成關(guān)鍵酶，亦為Nrf2-ARE通路的Ⅱ相解毒酶，由GCLC和GCLM組成，其中前者分子量較大，負(fù)責(zé)ATP依賴(lài)性谷氨酸的γ-羧基和半胱氨酸氨基的連接形成[10]。后者分子量較小，通過(guò)直接與GCLC相互作用增加其催化效率。兩者對(duì)GSH合成亦起著關(guān)鍵性的作用[11]，其表達(dá)下調(diào)可引起細(xì)胞GSH合成減少，清除ROS能力下降，從而促進(jìn)細(xì)胞損傷[12]。Nrf2的表達(dá)增加，GCLC則隨之増加，上調(diào)GCLC的表達(dá)，能夠減輕有機(jī)毒物引起的氧化應(yīng)激性損傷[13]。在一些諸如阿爾茲海默病、帕金森病等神經(jīng)變性病當(dāng)中觀察到二者的表達(dá)下降，應(yīng)用抗氧化劑后，兩者均上調(diào)[14～16]。而在腦血管病二者表達(dá)的變化中國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷后，NQO1、GCLC及GCLM表達(dá)均明顯上升，進(jìn)而減少ROS的形成，并使GSH合成催化效率提高，使細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)更趨于平衡，最終減輕了神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。提示大鼠在I/R損傷后，可能通過(guò)藥物影響Nrf2信號(hào)通路的下游GCLC、NQO1等蛋白的表達(dá)水平而發(fā)揮抗氧化作用從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用，這可能為腦缺血再灌注損傷的治療提供新靶點(diǎn)和新思路。