解毒護肝方對APAP肝損傷大鼠HSP70蛋白表達的影響

王 茜，張一昕，郭秋紅，郝 蕾，韓 雪，石 鋮，劉 宇

(河北中醫(yī)學院 藥學院，河北 石家莊 050200)

熱休克蛋白(HSPs)是在生物進化過程中高度保守的多肽蛋白，而HSP70則是最保守、最重要的一族，在應激反應中最敏感[1]。對乙酰氨基酚(APAP)是目前國際上常用的肝炎、藥物性肝損傷模型用藥之一，其可降低肝細胞的抗氧化能力，從而使肝細胞產(chǎn)生氧化應激性損傷[2]。研究顯示，小鼠在注射對乙酰氨基酚后24 h，肝臟轉氨酶活性達到峰值，HSP70的表達量也達到高峰，說明HSP70的表達變化可作為評價肝損傷或修復過程中的重要指標[3]。解毒護肝方為課題組治療肝損傷的臨床效用方，本實驗主要研究其基于HSP70的保肝作用機制。

1 材料及試劑

1.1 動物

Wistar大鼠，清潔級，雌雄各半，體重180～220 g，共70只，由北京維通利華生物技術有限公司提供，實驗動物合格證號：11400700181914，生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2012-0001。實驗動物飼養(yǎng)于恒溫恒濕環(huán)境中[溫度：(23±2) ℃，相對濕度：60% ～ 70%]，12 h明/暗交替，動物自由進食水[SYXK(冀)2016-0047]。

1.2 藥物

解毒護肝方由柴胡、醋香附、炒白芍、五味子、黃芪、白術、茵陳、黃芩、丹參、楮實子、生甘草組成。方中所用藥物均為免煎顆粒，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司提供。水飛薊賓膠囊(每粒含水飛薊賓35 mg，批號：750709172)，由天津天士力圣特制藥有限公司生產(chǎn)；對乙酰氨基酚片(每片含對乙酰氨基酚0.5 g，批號：016171002)由石藥集團歐意藥業(yè)有限公司提供。

1.3 試劑

天門冬氨酸氨基轉移酶測定試劑盒(AST，批號：AUZ3645)，丙氨酸氨基轉移酶測定試劑盒(ALT，批號：AUZ3689)由貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)有限公司提供；總膽紅素試劑盒(TBIL，批號：A005)，直接膽紅素試劑盒(DBIL，批號：A006)由長春匯力生物技術有限公司；蘋果酸脫氫酶試劑盒(MDH，SEH673Ra，Cloud-Clone Corp)、谷氨酸脫氫酶試劑盒(GLDH，SEA293Ra，Cloud-Clone Corp)、精氨酸酶試劑盒(ARG，SEB120Ra，Cloud-Clone Corp)，HSP70抗體(rabbit，17T01602)購自abcam公司，二抗(rabbit，K166-918D)以及DAB(K172410E)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.4 主要儀器

Humalyzer2000半自動生化儀(德國豪邁)；DP73數(shù)碼顯微鏡(Olympus)；HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)(武漢同濟醫(yī)科大學)；酶標儀(BIO-TEK，ELx800)；低溫離心機(Sigma，德國)；高速離心機(上海醫(yī)用分析儀器廠)等。

2 方法

2.1 分組給藥

將大鼠按體重隨機分為正常組，模型組，水飛薊賓陽性對照組，解毒護肝方高、中、低劑量組，共六組，其中正常組10只，其余每組各12只，雌雄各半。各組大鼠的給藥劑量按照人與大鼠體表系數(shù)法進行換算，解毒護肝方低劑量組為成人等效劑量，中劑量組為等效劑量的2倍，高劑量組為等效劑量的4倍，每天上午8∶00模型組和各給藥組給予對乙酰氨基酚1 000 mg·kg-1(用40 ℃生理鹽水配制)1次，正常組給予生理鹽水灌胃；每天下午2∶00正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，各給藥組給予相應藥液灌胃，給藥體積均為1 mL/100 g，連續(xù)灌胃30天。每7天稱重，自由進食水。

2.2 樣本采集

實驗結束時，3.5%水合氯醛(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血，全血分別置于清潔試管中，分別以4 000 r/min，離心10 min，分離血清，分裝后置于-80 ℃冰箱保存，待檢相關肝功能指標。取血后迅速取固定部位肝組織2份，一份置于4%多聚甲醛液中固定，待觀察肝組織HSP70蛋白表達情況。

2.3 指標檢測

2.3.1 一般情況觀察 給藥后觀察大鼠精神狀態(tài)、行為活動、飲食情況、二便情況、皮膚毛色。

2.3.2 血清指標檢測 由于實驗過程有動物死亡，每組選取8個樣本，利用半自動生化分析儀按照試劑盒說明書檢測血清AST、ALT、DBIL、TBIL的含量；利用酶標儀根據(jù)試劑盒說明書檢測血清MDH、GLDH、ARG的含量。

2.3.3 肝組織HSP70蛋白表達檢測 用免疫組化法進行觀察，每組取6例，每例測5個視野。由計算機算出所測陽性反應物相對含量的灰度值及面積，由積分光密度值(IOD)和平均光密度值(MOD)來表示。

2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.5軟件進行處理，計量資料采用方差分析，方差齊選用LSD，方差不齊選用Dunnett T3。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 解毒護肝方對肝損傷大鼠一般情況的影響

正常組大鼠毛發(fā)滑順，有光澤，精神狀態(tài)良好，行動靈活，二便正常；對乙酰氨基酚大鼠體重減輕，毛發(fā)無光澤，精神狀態(tài)欠佳，喜臥。解毒護肝方和水飛薊賓對照組大鼠能不同程度地改善大鼠的毛發(fā)光澤度、精神狀態(tài)、體重情況以及行動靈活性情況。

3.2 解毒護肝方對藥物性肝損傷大鼠肝功能指標的影響

給予大鼠對乙酰氨基酚灌胃30天后，ALT、AST、DBIL水平顯著升高(P<0.01)；水飛薊賓組和中、低劑量組能顯著降低肝損傷大鼠的ALT、AST活性(P<0.01，P<0.05)，低劑量組能顯著降低肝損傷大鼠的DBIL含量(P<0.05)；解毒護肝方各劑量組之間中劑量組對ALT、AST活性的影響較高劑量組明顯(P<0.05)。但各劑量組之間對總膽紅素(TBIL)含量的影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

組別ALT(U/L)AST(U/L)DBIL(μM)TBIL(μM)正常組72.81±9.83187.67±30.251.56±0.122.58±0.34模型組97.51±18.79△△236.49±41.32△△2.42±0.34△△3.19±0.81水飛薊賓組80.36±14.07▲190.46±29.98▲2.12±0.38△2.70±0.74高劑量組91.64±15.34△□□200.05±21.00□2.00±0.512.85±0.79中劑量組69.33±10.57▲▲159.27±24.76▲▲2.05±0.712.92±0.88低劑量組81.18±20.71▲198.32±54.37▲□1.80±0.45▲2.51±0.39

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與中劑量組比較，□P<0.05，□□P<0.01。

3.3 解毒護肝方對藥物性肝損傷大鼠血清生物標志物的影響

大鼠給予對乙酰氨基酚藥液30天后，血清PON1、ARG、GLDH、MDH、PNP的含量均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，高劑量組能顯著降低肝損傷大鼠血清PON1、MDH含量(P<0.05)，而對血清ARG、GLDH含量有降低趨勢，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。中劑量組均能降低肝損傷大鼠血清PON1、ARG、GLDH、MDH、PNP含量，其中對于肝損傷大鼠血清ARG、MDH的含量降低最為明顯，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。低劑量組僅對血清PON1、MDH、PNP有降低趨勢(P>0.05)，而對其他指標無影響。見表2。

組別ARGGLDHMDH正常組63.53±14.6116.21±1.7513.39±2.97模型組79.69±11.75△20.62±3.55△20.31±2.66△△水飛薊賓組67.16±11.1119.50±3.5921.22±4.78△△高劑量組66.33±12.1817.90±3.3516.26±1.45▲□□中劑量組62.49±14.16△▲17.64±4.4416.81±1.57△▲□□低劑量組78.08±15.6320.65±3.16△18.11±1.72△△□

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與水飛薊賓組比較，□P<0.05，□□P<0.01。

3.4 解毒護肝方對藥物性肝損傷大鼠肝臟HSP70蛋白表達的影響

大鼠給予對乙酰氨基酚藥液30天后，肝組織HSP70蛋白表達的IOD和MOD值顯著升高(P<0.05，P<0.01)；各給藥組均能顯著降低肝損傷大鼠的IOD和MOD值(P<0.01)；中、低劑量組HSP70蛋白表達較水飛薊賓對照組明顯降低(P<0.05，P<0.01)；各劑量組之間，以高、中、低劑量組對肝損傷大鼠HSP70蛋白表達的修復作用有一定的量效關系，以高、中劑量組效果較好(P<0.01)。見表3，圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6。

組別 積分光密度(IOD) 平均光密度(MOD)正常組38.99±13.680.085 4±0.0124模型組375.68±28.78△△0.198 5±0.0281△△水飛薊賓組264.69±41.85△△▲▲0.109 9±0.0158▲▲高劑量組247.20±30.63△△▲▲0.084 0±0.0219▲▲中劑量組220.85±17.16△△▲▲□0.127 2±0.0223△△▲▲※※低劑量組339.11±26.41△△▲□□※※●●0.1599±0.0279△△▲▲□□※※●●

注：與正常組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與水飛薊賓組比較，□P<0.05，□□P<0.01；與高劑量比較，※P<0.05，※※P<0.01；與中劑量組比較，●P<0.05，●●P<0.01。

圖1 各組大鼠肝組織HSP70蛋白表達情況(組化，×20)

4 討論

藥物性肝損傷由于其特殊性若能早期診斷，早期停藥治療則能在很大程度上提高患者的生活質量。臨床常用血清轉氨酶和膽紅素的升高作為肝損傷的主要評價標準，但這些指標主要用于肝損傷發(fā)生后的診斷檢測。因此，尋找靈敏度高、特異性好的潛在生物標志物是需要亟待解決的問題。

近年來許多學者均致力于發(fā)現(xiàn)能早期診斷，且具有良好穩(wěn)定性的肝損傷生物標志物，認為存在于肝臟的一種線粒體酶GLDH，在人體內水平較為穩(wěn)定，其靈敏性高于ALT[4]；而存在于肝臟一種催化反應酶ARG，則在診斷膽管損傷方面敏感度最高[5]。MDH為三羧酸循環(huán)中參與草酰乙酸與蘋果酸轉化的關鍵酶，若該循環(huán)被破壞，則肝細胞中的MDH迅速釋放進入血清，而此時ALT并未發(fā)生變化[6]。朱平生團隊通過用四氯化碳、對乙酰氨基酚、酒精復制不同類型的肝損傷模型，發(fā)現(xiàn)血清GLDH，ARG，嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)，α-谷胱甘肽-S-轉移酶(α-GST)聯(lián)合評價，對于及早發(fā)現(xiàn)肝損傷靈敏性更強[7]。本實驗結果顯示，模型組大鼠血清中ALT、AST、DBIL、MDH、GLDH、ARG含量顯著升高。解毒護肝方各劑量組能夠降低模型大鼠血清中ALT、AST、TBIL、DBIL、MDH、GLDH、ARG含量，提示解毒護肝方對APAP誘導的藥物性肝損傷具有良好的保護作用。

HSP70 具有分子伴侶的作用，在蛋白質發(fā)生構象異常變化時，可避免其內部非疏水性氨基酸與一些肽、核酸分子或大分子發(fā)生不良的相互作用[8-9]。當肝臟受到藥物刺激，發(fā)生應激反應時，可能會刺激肝臟內部的蛋白質結構發(fā)生變化，HSP70通過不斷的和蛋白質結合或釋放，修復損傷的蛋白質結構，進而促進肝組織的修復發(fā)揮保肝作用[10]。本實驗結果顯示，對乙酰氨基酚大鼠HSP70蛋白表達升高，而解毒護肝方各劑量組均能不同程度的降低模型組大鼠的HSP70表達。綜上所述，解毒護肝方有較好的護肝作用，不僅能降低轉氨酶和膽紅素等傳統(tǒng)肝功能指標的水平，還能降低早期標志物的水平，因此能起到一定的防治作用，其作用機理通過降低HSP70蛋白表達來實現(xiàn)。但藥物所致的肝損傷是否影響了肝臟內部某蛋白構象的變化以及解毒護肝方是否通過調節(jié)HSP70蛋白表達修復蛋白構象發(fā)揮保肝作用，還需進行深入研究。