益氣養陰方通過p53依賴AKT/NF-κB信號傳導抑制肺癌細胞增殖研究

阮廣欣，周 蕾

(上海中醫藥大學附屬龍華醫院 腫瘤科，上海 200030)

原發性支氣管肺癌是嚴重危害人類健康的疾病之一，近年來成為因癌癥死亡率最高的腫瘤[1]。中醫益氣養陰法是國醫大師劉嘉湘教授以“扶正治癌”學術思想為指導的核心治則。多項臨床研究表明，應用益氣養陰法及其核心藥物在縮小穩定病灶、抗肺癌轉移、延長生存期及提高生存率等方面均顯示出良好的療效，同時在改善癥狀、提高生存質量、改善免疫功能等方面亦有良好的作用[2-5]。在藥物作用機制方面，應用益氣養陰法及其核心藥物具有抑制肺癌細胞及干細胞增殖、促進細胞凋亡的作用[6-8]。本研究擬結合中醫藥治療肺癌具有綜合調節、多靶點的作用特點，對益氣養陰法核心處方益氣養陰方如何影響肺癌細胞增殖及存活的分子機制展開研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細胞系 人肺癌細胞株A549(p53野生型)、H1299(p53缺失型)，均購自于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。A549及H1299細胞培養液含有RPMI-1640(Gibco公司)，10%小牛血清和1%兩性霉素，同時孵育于5% CO2，溫度為37 ℃的培養箱中。

1.1.2 實驗藥物 益氣養陰方由黃芪等12味中藥配方(四川新綠色藥業科技發展股份有限公司)組成，其中黃芪14.6 g、北沙參14.6 g、天冬4.9 g、麥冬4.9 g、石上柏14.6 g、石見穿14.6 g、重樓7.3 g、女貞子4.9 g、山茱萸4.9 g、仙靈脾4.9 g、葫蘆巴4.9 g、絞股藍4.9 g。

1.1.3 主要試劑 MTS試劑盒：CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(a)(普洛麥格公司，美國)；單克隆抗體：NFκB P65、Phospho-NFκB (Ser 536)、IKKα、 Phospho-IKKα/β、AKT、Phospho-AKT (Ser 473)、p53，(Cell signal公司，美國)；β-Actin(Novus公司，美國)；抗體稀釋度為1∶1 000；Trizol試劑，Super Script II Reverse Transcriptase(Invitrogen公司，美國)；SYBR Green PCR Master Mix(Bestar公司，德國)。

1.1.4 主要儀器 多功能酶標儀(BioTek，美國)；凝膠成像系統(GelDoc)(Bio-Rad，美國)；Nanodrop 2000核酸定量儀(Thermo，美國)；ABI Step One Real-time PCR儀(ABI，美國)；熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)；CO2細胞培養箱(TECAN，瑞士)。

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 益氣養陰復方顆粒以80 ℃蒸餾水100 mL震蕩溶解60 min，冷卻后用濾膜孔徑為0.22 μm的Millex針頭式過濾器，對益氣養陰方溶液進行滅菌后裝入無菌管，再用PBS稀釋成梯度濃度以備用。

1.2.2 抑制細胞增殖研究 采用MTS法觀察不同濃度益氣養陰方對A549及H1299肺癌細胞增殖的抑制作用。取對數生長期的A549細胞及H1299細胞，以每孔3 000個細胞/100 μL接種于96孔培養板中，孵育24 h后分別加入梯度濃度的益氣養陰方，以及空白對照組；37 ℃溫箱中再培養24 h后，每孔加入MTS試劑(2 mg/mL)20 μL，孵育4 h后，用酶標儀以490 nm波長測定吸光度(OD)。計算出各組細胞增殖抑制率，并計算出益氣養陰方作用于A549及H1299細胞的半抑制濃度數值(IC50)。細胞生長率計算公式：抑制率(%)= (對照組A490值-實驗組A490值)/(對照組A490值-空白對照組A490值)×100%。

1.2.3 通過AKT/NF-κB信號通路抑制細胞存活研究 采用Western Blotting法檢測：根據益氣養陰方抑制肺癌細胞增殖IC50劑量，分別于不同時間點收集細胞(1×107)，用細胞裂解液(RIPA Buffer)收集細胞沉淀，于冰上提取細胞總蛋白，Brandford法測定蛋白含量。100 ℃變性5min，等量蛋白上樣。進行SDS-PAGE凝膠電泳后，轉膜。5%BSA室溫封閉2h，經與一抗NF-κB P65，Phospho-NF-κB(Ser 536)、IKKα、Phospho-IKKα/β、AKT、Phospho-AKT (Ser 473)、P53及β-tublin在4 ℃孵育過夜、二抗孵育后，加DAB顯色，在凝膠成像儀上觀察并進行光密度分析。

1.2.4 對A549肺癌細胞P53下游基因影響研究 采用RT-PCR檢測：根據益氣養陰方抑制肺癌細胞增殖IC50劑量，分別于不同時間點收集細胞(1×107)：RNA提取用Invitrogen公司TRIzol TM裂解細胞，加入氯仿分離溶解蛋白有機相，收集RNA組分水相，異丙醇沉淀RNA，依次經75%乙醇洗滌、DEPC水溶解，變性后以RNase free DNase消化可能殘存的DNA，Nanodrop 2000核酸定量儀測定獲得RNA濃度，并保存于-80 ℃備用。

RNA與Olig-dt-18在70 ℃變性5 min后，在逆轉錄酶的作用下42 ℃反應1h，獲得cDNA。cDNA與相應基因特異引物在dNTP、酶緩沖液、氯化鎂、Taq酶等條件下作PCR反應，反應條件初步設為：50 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 min，55 ℃退火1 min，60 ℃延伸90 s，共40循環；最后再延伸5 min以充分反應。具體反應條件可逐步摸索或用梯度PCR儀進行，并以GAPDH作為參照以ABI Step One Real-time PCR System定量分析基因的表達強度。實驗擴增引物序列如下：

p53：F：5′-GTTCCGAGAGCTGAATGAGG-3′，R：5′-TTATGGCGGGAGGTAGACTG-3′；

Puma (BBC3)：F：5′-GAAGAGCAAATGAGCCAAACG-3′，R：5′-GGAGCAACCGGCAAACG-3′；

BAX：F：5′-GCCCTTTTGCTTCAGGGTTT-3′，R：5′-TCCAATGTCCAGCCCATGAT-3′；

BIM：F：5′-GATCCTTCCAGTGGGTATTTCTCTT-3′，R：5′-ACTGAGATAGTGGTTGAAGGCCTGG-3′；

GAPDH：F：5′-TCTACGAGTGGATGGTGCGTT-3′，R：5′-CGACTATGCAGTGACAGGTTGTG-3′

1.3 統計學方法

實驗數據采用SPSS 22.0軟件進行分析，實驗結果差異分析采用StudentT檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖抑制情況

益氣養陰方可抑制A549及H1299肺癌細胞的增殖，且該抑制作用呈現劑量依賴性。益氣養陰方作用于A549肺癌細胞24 h的IC50值約為0.22 g/mL，作用于H1299肺癌細胞24 h的IC50值約為0.15 g/mL。見圖1。

圖1 益氣養陰方對A549、H1299細胞增殖抑制作用

2.2 抑制細胞存活情況

益氣養陰方可通過下調A549細胞AKT及其磷酸化蛋白的表達，從而下調AKT靶蛋白IKKα/β的磷酸化表達，并終導致下游蛋白NF-κB磷酸化下調，抑制肺癌細胞存活，且該抑制作用在益氣養陰方干預24 h后最為明顯，對磷酸化AKT及NF-κB蛋白表達抑制率分別為84.9%、91.8%；而對于H1299細胞，益氣養陰方對于AKT及磷酸化、NF-κB及磷酸化的影響均不明顯。結果提示，益氣養陰方可以通過AKT/NF-κB信號通路抑制肺癌細胞存活，而這種抑制作用可能依賴于p53的表達。見圖2、圖3。

圖2 益氣養陰方對AKT/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

圖3 益氣養陰方對A549細胞磷酸化AKT及NF-κB蛋白表達的影響

2.3 增加腫瘤抑制蛋白p53表達

益氣養陰方可以增加A549細胞p53蛋白的表達，且該作用呈現時間依賴性，在益氣養陰方干預24 h后,p53蛋白表達明顯增長率為214.8%。見圖4。

圖4 益氣養陰方對A549細胞P53蛋白表達的影響

2.4 上調p53及下游基因BAX、Bim、Puma的表達

益氣養陰方可以上調A549細胞p53及下游基因(Bcl-2家族基因)BAX、Bim、Puma表達，且該作用呈現時間依賴性。見圖5。

注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001

3 討論

國醫大師劉嘉湘教授首倡“扶正法”治療惡性腫瘤，經過數十年的臨床觀察及研究，形成了完善的學術思想體系，其中益氣養陰法是“扶正治癌”的核心治則，被廣泛地應用于肺癌的治療。體內外實驗研究也揭示益氣養陰法核心藥物具有抑制腫瘤細胞增殖、浸潤和轉移，促進細胞凋亡的作用，并且可能通過降低耐藥腫瘤細胞膜轉運蛋白的表達而逆轉腫瘤[6-7]；最近有研究表明益氣養陰法可通過抑制耐藥相關蛋白的表達，從而抑制Lewis肺癌Sca-1+干細胞亞群增殖[8]；通過逆轉凋亡抵抗來逆轉吉非替尼的獲得性耐藥[9-10]。但益氣養陰法如何抑制肺癌細胞存活方面的研究則少有報道。

腫瘤是指細胞在致瘤因素作用下，基因發生改變，即癌基因與抑癌基因平衡被破壞，失去對其生長的正常調控，導致細胞異常增殖。因此，如何抑制細胞增殖、減少腫瘤細胞存活是腫瘤治療的關鍵。蛋白激酶AKT通過調節下游多種信號傳導可以影響腫瘤細胞增殖、凋亡以及細胞存活等，其中，AKT可以通過激活IKK及下游因子NF-κB是一條調節細胞存活、影響細胞存活的關鍵通路。研究表明抑制AKT/NF-κB信號傳導通路能夠誘導腫瘤細胞凋亡、抑制細胞增殖及存活[11-12]。蛋白質磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機制，AKT正是通過磷酸化作用影響下游效應物如IKK、NF-κB等，最終激活腫瘤細胞存活[13]。p53是抑制腫瘤生長的關鍵因子和蛋白，NF-κB轉錄因子則為細胞應激反應中重要的多功能調節因子，兩者之間存在相互作用。其機理之一是NF-κB通過調控p53的E3泛素連接酶Mdm2的水平(由IKKβ介導)，從而下調P53的穩定性，抑制DNA損傷引起的p53活化[14-15]。另外，p53 和NF-κB通路均受到PI3K-AKT信號的調控，在增加Mdm2核轉位的同時下調 p53的表達，而AKT激活被抑制可使Mdm2在胞漿滯留，同時通過AKT介導的IKK磷酸化激活NF-κB信號通路，影響細胞存活[16]。因此，AKT、NF-κB以及p53均是影響細胞生長及存活的關鍵轉化因子和蛋白，也被視作抗癌藥物作用的效應靶點。本研究結果顯示，益氣養陰方可以通過下調AKT/NF-κB信號通路抑制肺癌細胞增殖與存活，且抑制作用與p53表達與否密切相關。

p53作為腫瘤抑制因子的功能，主要是通過調控其下游靶基因的表達，從而實現維持基因組的穩定、避免突變發生的功能。Bcl-2家族基因是p53下游重要的靶基因，是控制線粒體致凋亡因子釋放的主要調節因子，主要包括促凋亡因子Bax、Bim、Puma[17-20]。由于DNA受損而使腫瘤抑制基因p53活化，上調Bcl-2家族中細胞促凋亡前蛋白Bax、Bim、Puma的表達，進一步導致線粒體內外膜間凋亡前物質細胞色素C和Smac/DIABLO的釋放，從而啟動線粒體介導的細胞凋亡，即內在途徑(線粒體途徑)[21]。

本研究結果顯示益氣養陰方通過上調p53及其下游基因BAX、Bim、Puma的表達促進肺癌細胞凋亡，從另一方面詮釋了既往研究所得到的益氣養陰方具有促進肺癌細胞凋亡的作用及途徑。本研究發現，腫瘤抑制因子p53可能是中醫益氣養陰法影響肺癌細胞周期變化的關鍵靶點之一，為以后開展進一步臨床及機制研究提供了新的角度和思路。