貴州不同產地雪膽藥材有效成分研究

王志春，陳薇薇，郭小梅，沈昱翔

(安順學院，貴州 安順 561000)

雪膽為西南民間常用藥材，基源為葫蘆科植物雪膽屬(Hemsleya)多種植物的塊莖。本屬植物按照中國植物志記載共31種，其中包括10個變種[1]，在我國西南地區都有分布[2]，其中貴州、云南、四川三省擁有全屬植物的92%[3，4]。雪膽具有抗菌消炎、清熱解毒等功效，在臨床治療冠心病、腸炎、氣管炎、慢性子宮頸炎、菌痢等多種疾病時都應用到了此藥材，并對保肝、抗癌等也發著揮極大作用[5-8]；雪膽屬植物具有抗菌、抗炎、溶血、抗癌等活性作用的物質基礎是其含有葫蘆素和齊墩果烷兩大類三萜皂苷[9]。

貴州地區常稱雪膽屬藥用植物為“蛇蓮”“苦金盆”[10]，貴州地區亦是雪膽商品藥材的重要產地，當地多民族廣泛使用此類藥材，如貴州知名藥企“神奇藥業”著名民族藥“雪膽素片”就是以其為原料生產，因此雪膽屬植物為貴州省重要的藥用植物資源，但是目前關于貴州省雪膽藥材資源的相關研究較少。為保證用藥安全，本研究調查了貴州雪膽屬藥用資源的分布情況，并收集了貴州興義、畢節、安順、遵義、六盤水等不同產地的雪膽塊莖樣品，并對醇溶性浸出物、總黃酮、雪膽素甲和總皂苷含量進行了檢測并分析其相關性因素，以期為以后大規模的種植和資源開發利用提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

賽多利斯Bp211DAG電子天平(德國Sartorius公司)；Agilent1200 Series高效液相色譜儀(G1316B柱溫箱、G1312B四元梯度泵、G1315C二極管陣列紫外檢測器、G1322A脫氣機、G1329B自動進樣器)；超聲波清洗器KQ5200DB(昆山市超聲儀器有限公司提供)。

1.2 實驗材料

雪膽素甲(111518-201103)由中國食品藥品檢定研究院提供；齊墩果酸對照品、蘆丁對照品由阿拉丁試劑(上海)有限公司提供；水為重蒸餾水；乙腈為色譜純；乙醇、甲醇、冰醋酸、石油醚、硝酸鋁、正丁醇、高氯酸、香草醛、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等試劑均為國產分析純。

雪膽藥材收集于貴州不同產區，所有樣品均收集帶有地上部分的植株以利于鑒定，對應塊莖帶回實驗室備用，樣品情況見表1。

2 研究方法

2.1 樣品處理

對貴州興義、畢節、遵義、安順、六盤水等雪膽藥材產地進行調查，查閱文獻資料，整理及分析貴州雪膽藥材的資源使用情況。清洗野外收集到的雪膽塊莖，對其鮮重進行稱量、切片，將其自然陰干，陰干后的材料研磨成粉末狀，用于總黃酮、醇溶性浸出物、雪膽甲素含量及總皂苷的檢測，每組實驗重復做5個。

2.2 雪膽甲素含量的測定

2.2.1 色譜條件和系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠填充；以乙腈∶水=40∶60，檢測波長為212 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃。

2.2.2 對照品溶液的制備 取適量的雪膽素甲對照品，稱重，加乙腈，制成每1.0 mL含0.143 mg雪膽素甲的對照品溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別稱取每個樣品粉末約1.0 g，稱定重量，置于帶瓶塞的錐形瓶中，加入25 mL甲醇，稱定重量，先超聲處理30 min，然后放冷，再稱定重量，減失的重量用甲醇補足，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.3 總皂苷含量的測定

2.3.1 供試液的制備 每個樣品各稱取粉末 1.0 g，加入70%乙醇15 mL，提取1 h，共提取5次。將濾液合并且揮干其溶劑，用蒸餾水定容至10 mL，先用20 mL石油醚脫脂，然后用適量正丁醇萃取并揮干萃取液，用 50%乙醇定容得到溶劑50 mL備用。

2.3.2 對照品溶液的制備 稱取齊墩果酸對照品1.8 mg，置入燒杯，然后用甲醇溶解，并稀釋至 25 mL，作為對照品溶液。

2.3.3 標準曲線的制備 量取對照品溶液1.2、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0 mL置于試管，放水浴鍋中加熱揮干其甲醇，加入新配5%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL和高氯酸1.0 mL，在65 ℃下水浴加熱20 min。放冷，待冷卻至室溫后加10 mL冰醋酸，并將其搖勻。繪制出標準曲線，得到回歸方程：Y=0.426 4X-0.151 9，R1=0.999 5。

2.3.4 樣品溶液的測定 取0.6 mL樣品溶液，按照標準曲線的制備方法測定樣品，總皂苷含量的計算對照標準曲線方程進行[11]。

2.4 總黃酮含量的測定

參考鐘文等[12]所用方法制備供試液、對照品溶液及標準曲線，得到回歸方程：Y=0.167 4X+0.036 8，R2=0.999 3。

2.4.1 樣品溶液的測定 量取1.00 mL黃酮提取液，置于 10 mL 容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，靜置 8 min；再加入 10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，放置8 min；加入 5%氫氧化鈉溶液 5 mL，再加水至刻度，搖勻，靜置20 min；總黃酮的含量根據標準曲線計算得出。

2.5 醇溶性浸出物用熱侵法進行測定

參照《中國藥典》(2010年版1部)附錄 X A 醇溶性浸出物測定法[13]。精密稱取各樣品粉末2 g，各置于具塞圓底燒瓶(100 mL)中，加水50 mL，蓋上瓶塞，稱重，放置1h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸狀態1 h；放冷，冷卻后取下圓底燒瓶，蓋上瓶塞，稱定其重量，把減失的重量用水補足，搖勻后過濾；用量筒量取濾液25 mL，放入蒸發皿中，用水浴蒸干后，在105 ℃下，干燥3 h，移置干燥器中，冷卻1 h，立刻稱其重量；樣品中含水溶性浸出物的百分數以干燥品來計算。

3 結果

3.1 貴州雪膽屬資源概況

根據《Flora of China》與《云南雪膽屬植物藥用資源的初步研究》的記載，貴州有8種、1原亞種、3原變種雪膽屬植物具有塊莖[14，15]，主要分布在貴州西部、西北部及東南部至西南部地區，由于其屬在貴州分布范圍較廣，本項目組實際收集到帶花、果等繁殖器官的雪膽植株標本共7份，經貴州省安順學院陳薇薇老師鑒定其基源為肉花雪膽(HemsleyacarnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)和雪膽(H.amabilisDiels)兩種，其中肉花雪膽(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)主要分布在貴州西北部到西部海拔較高的區域(本次收集到肉花雪膽樣品海拔均為1 500 m以上)，資源量大，并且在畢節、黔西南等地已經有一定規模的引種栽培，并形成商品；而雪膽(H.amabilisDiels)則分布在海拔較低區域，未見有大量栽培引種，多為當地民間使用，商品量較少。

表1 雪膽屬藥材樣品調查結果

3.2 不同產地雪膽藥材有效成分含量及品質差異

本研究收集到貴州7個雪膽樣品的雪膽甲素平均含量為1.39%，總黃酮的平均含量為2.24%，總皂苷的平均含量為0.78%，醇溶性浸出物的平均含量為17.09%。總體來看，貴州雪膽有效成分含量較高。其中樣品S3(桂果鎮)的雪膽甲素含量最高，達4.46%，比平均含量高出3.07%；總皂苷含量最高的是樣品S3，含量為1.08%，比平均含量高0.30%；總黃酮最高的也是樣品S3，含量為5.19%，比平均含量高2.95%；醇溶性浸出物含量最高的樣品還是S3，含量為22.78%，比平均含量高5.69%。綜合分析雪膽甲素、總皂苷、總黃酮及醇溶性浸出物等多個指標，樣品S3的藥材品質優良。本項目所收集的7個樣品中，基源為雪膽(H.amabilisDiels)的有3個，雪膽甲素的平均含量是2.27%，總黃酮的平均含量是2.99%，總皂苷的平均含量是0.96%，醇溶性浸出物的平均含量是16.47%。基源為肉花雪膽(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)的有4個，雪膽甲素的平均含量是0.73%，總黃酮的平均含量是1.69%，總皂苷的平均含量是0.65%，醇溶性浸出物的平均含量是17.56%。結果表明，肉花雪膽(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)的雪膽甲素、總皂苷、總黃酮均高于雪膽(H.amabilisDiels)，而醇溶性浸出物低于雪膽(H.amabilisDiels)。總體分析，不同產地雪膽藥材活性成分含量有差異，其中畢節市桂果鎮所產樣品有效成分含量高于六盤水市普古鎮、安順市貓營鎮等地樣品，品質優良；肉花雪膽(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)藥材品質優于雪膽(H.amabilisDiels)藥材。檢測結果見表2和圖1。

表2 不同產地有效成分檢測結果 (%)

注：n=3。

圖1 不同產地雪膽有效成分含量差異

4 討論

雪膽是我國重要的藥用植物，作為民間藥材和原料藥材，具有較大的市場需求，然而目前主要依靠野生植株提供商品，加上長期掠奪性采挖，目前雪膽資源已經出現危機，野生資源逐漸稀少。據文獻記載，貴州具塊莖雪膽共有8種、1原亞種、3原變種，但是本次調查僅收集到2種，即肉花雪膽(H.carnosifloraC.Y.Wu et C.L.Chen)和雪膽(H.amabilisDiels)，前者多分布于貴州西部、西北部海拔1 500 m以上區域的闊葉林下或灌木從中，而后者則分布在海拔1 000 m左右低海拔闊葉林中。在走訪過程中，據藥農反映近年來雪膽的資源逐漸減少，個頭大的植株已多年不見，表明雪膽屬植物資源受到較嚴重的破壞，究其原因，可能與雪膽在多個地區的民間都有大量使用及商品收購，同時野生雪膽棲息環境被破壞等多種因素有關。目前市場上有多種以雪膽藥材為主要原料的藥品，甚至牙膏等日化用品的原料也有用到雪膽藥材，因此解決雪膽資源的日益減少勢在必行。在本次調查中發現，僅有桂果鎮、七舍鎮等部分地區在進行小規模人工栽培，栽培雪膽的資源量遠遠不能滿足市場需求，資源的缺乏已對制藥企業帶來極大的困擾。因此，應進一步研究雪膽植物的繁殖技術及繁殖方法，為規模化無性繁殖及人工馴化提供技術支撐。

本研究分析了貴州7個雪膽藥材樣品的主要藥用成分，包括雪膽甲素含量、總皂苷含量、總黃酮含量和醇溶性浸出物等，結果表明不同產地的雪膽藥材在藥用成分含量上存在一定的差異，雪膽藥材品質具有顯著的地域差異性。同時，根據實驗結果，貴州產肉花雪膽醇溶性浸出物的平均含量是22.78%，雪膽甲素的平均含量是4.46%，總黃酮的平均含量是5.19%，總皂苷的平均含量是1.08%，高于四川、浙江等地的藥材樣品[16，17]，同時肉花雪膽在貴州西北部地區，如畢節的桂果鎮、黔西南州七舍鎮等區域，已經有一定的規模化引種栽培，并形成了商品，其種植技術、種源獲取等均較雪膽屬其他品種成熟，表明肉花雪膽是優質的雪膽藥材儲備資源，在今后的研究中應該引起重視。

同時，雪膽藥材多用于提取如總皂苷等作為原料藥材使用，除塊莖外，尚有大量地上部分未被開發利用。林曉琴等[18]研究發現雪膽同屬植物馬銅鈴(H.gracilifloraCogn)，除塊莖外，花、葉、果實等也含有雪膽甲素等活性成分，因此我們可以進一步對貴州雪膽屬植物的莖、葉、果實等器官的有效成分進行研究，為開發、利用雪膽屬植物的非傳統藥用部位提供理論依據。