藏紅花素抑制過氧化氫誘導的視網膜色素上皮細胞凋亡

李姚，王健

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)屬于視網膜退行性疾病，該病病理學發生基礎為視網膜色素上皮(retina pigment epithelium，RPE)細胞[1]。RPE 細胞為單層柱狀細胞，容易受到周圍環境影響，RPE 細胞損傷后可引起光感受器變性、視網膜變薄[2]。藏紅花素（Crocin）是從藏紅花植物莖中提取的單體化合物，具有抗氧化、抑制炎癥反應、保護神經細胞等作用[3]。已有學者將其應用于眼部，發現藏紅花素能提高視網膜抗氧化能力、抑制視網膜神經節細胞凋亡、改善視網膜微循環的作用[4]。本文擬通過采用體外高氧條件下培養RPE 細胞，初步探討藏紅花素對H2O2誘導的RPE細胞凋亡的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

RPE 細胞(美國ATCC 公司)，藏紅花素(美國Sigma 公司，純度＞99%)，二甲基亞砜、H2O2（北京索萊寶科技有限公司），胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，杭州四季青公司)、MTT 試劑盒(江蘇凱基生物技術股份有限公司)，Annexin-V/PI 試劑盒及H2DCFDA 熒光探針 (美國BD 公司)，Bcl-2 及Bax抗體（上海碧云天公司）。

1.2 RPE 細胞培養及分組

RPE 細胞培養 將RPE 細胞置于DMEM 培養基中，內含10%胎牛血清，青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml，培養箱內溫度為37℃，CO2體積分數為5%，每3d 傳代1 次，取對數期生長的細胞進行實驗。

RPE 細胞分組 細胞接種于96 孔板中，共分4 組，每組5 個復孔。（1）對照組：以正常培養液培養；（2）氧化損傷組：培養液內H2O2濃度為300 μmol·L-1；（3）藏紅花素組：加入藏紅花素作用24 h之后，加入300 μmol·L-1H2O2溶液作用12 h，依藏紅花素濃度不同分為2 個亞組(10 μmol·L-1及100 μmol·L-1)。

1.3 MTT 法測定細胞增殖

RPE 細胞接種于96 孔板中，每孔200μl，細胞密度為1×104個/L，向各孔細胞中加入10μlMTT(5 g·L-1)，4 h 后吸出上清液，加入100 μL DMSO 溶液，輕微振蕩10 min 后測定各孔570 nm 的光密度值（OD）。細胞增殖率=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%。

1.4 流式細胞技術檢測RPE 細胞內活性氧（ROS）表達

RPE 細胞接種于6 孔培養板，0.1%胰酶（不含EDTA）消化各組細胞后制備細胞懸液。1000 r/min離心后收集細胞，加入5 μL H2DCFDA 染料后置于暗室內避光反應15 min，流式細胞儀檢測細胞內ROS 表達量變化。

1.5 Annexin V/PI 流式檢測細胞凋亡

0.1%胰酶（不含EDTA）消化各組細胞后制備細胞懸液。1000 r/min 離心后收集細胞，分別加入5μLAnnexin-V 和10μLPI 染料后充分混勻避光反應15 min，于1 h 內用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.6 Western blot 法檢測RPE 細胞內Caspase-3 及Caspase-9 的蛋白表達

提取蛋白質后上樣，電泳，聚偏氟乙烯膜轉膜后，質量分數為5%的脫脂奶粉封閉12 h，加入相應抗體，ECL 化學發光法自顯影，用Bio-Rad Quantity One 軟件分析電泳結果。

1.7 統計學方法

采用SPSS17.0 進行統計學處理，計量資料結果采用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用LSD-t 檢驗，各處理組組間比較采用兩因素方差分析，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度藏紅花素對RPE 細胞活力的影響

MTT 法檢測結果顯示（表1），對照組RPE 細胞存活率為98.33%±4.90%，氧化損傷組RPE 細胞存活率為43.12%±3.39%，與對照組比較差異有統計學意義（F=48.08，P＜0.05），不同濃度藏紅花素干預后，RPE 細胞存活率分別提高到61.76%±4.76%和77.67%±4.43%，與氧化損傷組比較差異均有統計學意義（F低=40.89，F高=90.33，均P＜0.05）。

表1 MTT 法檢測藏紅花素對H2O2誘導的RPE細胞存活率的影響（±s）

表1 MTT 法檢測藏紅花素對H2O2誘導的RPE細胞存活率的影響（±s）

注：* 與對照組比較，P＜0.05；# 與氧化損傷組比較，P＜0.05

2.2 RPE 細胞內ROS 改變

流式細胞技術結果顯示，氧化損傷組RPE 細胞內DCF 熒光信號明顯增強，表明細胞氧化損傷嚴重，不同濃度藏紅花素干預后，DCF 熒光信號強度逐漸減弱，表明藏紅花素抑制了細胞內ROS 生成，改變了RPE 細胞內的氧化應激狀態（圖1）。

2.3 藏紅花素抑制H2O2誘導的RPE 細胞凋亡

流式細胞儀的檢測結果表明（表2、圖2），與對照組（4.33%±2.50%）比較，氧化損傷組RPE 細胞凋亡率明顯升高（F=89.02，P＜0.05），隨著藏紅花素作用濃度的遞增，H2O2誘導的RPE 細胞凋亡率呈劑量（10 μmol·L-1及100 μmol·L-1）依賴性遞減（39.00%±3.77%、18.00%±3.80%），與氧化損傷組比較差異均有統計學意義（F低=192.40，F高=95.76，均P＜0.05）。

2.4 藏紅花素抑制H2O2誘導的線粒體凋亡信號通路的影響

與對照組相比，H2O2抑制RPE 細胞中抗信號分子Bcl-2 的表達，促進RPE 細胞中促凋亡信號分子Bax 的表達。經過藏紅花素處理后，Bcl-2 的表達升高，Bax 的表達下降（圖3、圖4）。

3 討論

視網膜特別容易受到氧化損傷影響，高濃度的多不飽和脂肪酸、持續的光照及密集的氧代謝產物促進了視網膜內細胞內活性氧（ROS）的生成[5]。體外補充抗氧化劑來維持視網膜的功能不失為一種防治視網膜氧化應激損傷的有效方法。藏紅花素分子式為C44H64O24，分子量為977.21 kD，抗氧化作用明顯。現代藥理學研究表明，藏紅花素具有保護神經細胞功能、降低胰島素抵抗、抑制腫瘤細胞增殖、治療慢性胃病、預防心血管疾病發生的功效[6-7]。近年來，一些學者將藏紅花素應用于體外培養的視網膜血管內皮細胞和視網膜神經節細胞，均顯示了藏紅花素有效的清除羥自由基、超氧自由基及抗凋亡作用。郭斌[4]發現藏紅花素通過抑制糖基化終產物誘導的視網膜微血管內皮細胞中ROS 的表達，保護視網膜微血管內皮細胞。呂伯昌[8]認為藏紅花素能有效抑制視網膜神經節細胞凋亡，其作用機制與影響Ca2+內流有關。

本實驗中，我們使用300 μmol·L-1H2O2建立了RPE 細胞氧化應激模型，觀察藏紅花素對RPE 細胞的保護作用。結果顯示，300 μmol·L-1H2O2引起RPE細胞活力降低，10 μmol·L-1及100 μmol·L-1藏紅花素作用于RPE 細胞后，RPE 細胞增殖率隨藏紅花素濃度的升高而升高，證實了藏紅花素對RPE 的保護作用。

圖1 流式細胞技術檢測RPE 細胞內ROS 改變。1A 對照組；1B 氧化損傷組；1C 藏紅花素低濃度組；1D 藏紅花素高濃度組

圖2 藏紅花素對H2O2 誘導RPE 細胞凋亡影響。2A 對照組；2B 氧化損傷組；2C 藏紅花素低濃度組；2D 藏紅花素高濃度組

圖3 藏紅花素對RPE 細胞內Bcl-2及Bax 表達的影響（電泳圖）

表2 流式細胞儀檢測藏紅花素對H2O2誘導的RPE 細胞凋亡率的影響（±s）

表2 流式細胞儀檢測藏紅花素對H2O2誘導的RPE 細胞凋亡率的影響（±s）

注：* 與對照組比較，P＜0.05；# 與氧化損傷組比較，P＜0.05

圖4 藏紅花素對RPE 細胞內Bcl-2 及Bax 表達的影響

氧化應激在AMD 發生發展中發揮重要作用，H2O2生成的ROS 導致蛋白質降解和上皮細胞損傷，與AMD 發生機制相似[9-10]。本實驗中，我們使用流式細胞儀分別檢測了細胞內ROS 生成量及細胞凋亡率，結果表明，H2O2促進了RPE 細胞內ROS 的生成和細胞凋亡，藏紅花素可以劑量依賴性的RPE 細胞氧化應激損傷。

Bcl-2 及Bax 均屬于細胞內線粒體凋亡信號通路中的信號分子。其中，Bcl-2 為抗凋亡蛋白，通過阻止細胞色素C 的釋放抑制凋亡；Bax 為促凋亡蛋白，通過誘導細胞色素C 的釋放促進凋亡[11]。Western blot 結果顯示，H2O2抑制RPE 細胞中抗信號分子Bcl-2 的表達，促進凋亡信號分子Bax 的表達，經過藏紅花素處理后，Bcl-2 的表達升高，Bax 的表達下降，進一步說明藏紅花素能夠有效抑制H2O2誘導的RPE 細胞凋亡。

總之，本研究初步證實藏紅花素對氧化應激環境下RPE 細胞的保護作用，為今后預防和治療視網膜退行性疾病提供了一定方向。