類過敏反應實驗研究進展

陳錳 上海中醫(yī)藥大學 上海 201203

類過敏反應已嚴重影響人類的生活質量，其癥狀與Ⅰ型過敏反應極為相似，涉及多器官系統(tǒng)，類過敏反應的發(fā)生率遠高于過敏反應，二者經常被混淆，但有著本質區(qū)別，類過敏反應通常在首次接觸致敏原即發(fā)生，是無需IgE介導的非抗原抗體反應。類過敏反應發(fā)生機制復雜，目前國內外對此尚不完全清楚，相關研究推測類過敏反應主要通過直接刺激MC途徑和激活補體系統(tǒng)途徑而引發(fā)。截至今日，國內外均未建立統(tǒng)一的檢測模型用于類過敏反應的臨床前評價，也沒有相關的技術指導原則發(fā)表【1】。因此，本文對類過敏反應相關體內外模型及實驗方法研究進行綜述，旨在為類過敏反應的檢測建立統(tǒng)一的臨床前評價標準提供指導，盡可能地減少藥物類過敏反應的發(fā)生，保障臨床用藥安全。

1 整體動物實驗研究：

選擇一種合適的動物實驗模型進行類過敏反應的評價備受關注，目前已經進行研究的實驗動物主要有Beagle犬、小型豬、豚鼠、大鼠和小鼠等，恒河猴和食蟹猴報道較少。不同動物或不同品系動物模型的敏感性及效應物質評價指標略有不同，下面逐一進行贅述。

1.1 Beagle犬模型：

有較多研究報道Beagle犬在首次靜脈注射致敏物質后很快出現與人類相似的類過敏反應癥狀，將Beagle犬出現的典型癥狀與其血漿組胺升高率為主要指標，IgE為輔助指標進行類過敏反應的評價。梁愛華等【2】以Beagle犬為受試動物，以含吐溫-80 和不含吐溫-80魚腥草注射液為主要受試藥物給與動物，發(fā)現Beagle犬迅速出現類過敏反應，并表現出與臨床高度一致的癥狀特點，建議作為中藥類過敏反應臨床前評價研究的理想動物模型。此外，梁愛華等【3】也進一步證實Beagle犬作為臨床前評價藥物類過敏反應動物模型的可行性。王志國等【4】通過對Beagle犬一次靜脈注射磷酸組胺注射液模擬臨床類過敏反應的發(fā)生，作者認為Beagle犬可以作為類過敏反應臨床前評價的敏感動物模型。孫偉偉等【5】以Beagle犬為類過敏反應的敏感動物模型來評價多種聚山梨酯80及其配制的魚腥草注射液靜脈注射給藥對Beagle犬的致敏性。該課題組在實驗過程中發(fā)現Beagle犬對類過敏實驗很敏感，且得出若控制聚山梨酯80的質量及限制其濃度可避免類過敏反應的發(fā)生。Qiu等【6】通過向Beagle犬注射吐溫80考察其致敏性實驗發(fā)現Beagle犬在生理指標的變化上與人類極為相似。閆位娟等【7】將臨床過敏性報道較多的中藥注射劑對Beagle犬、豚鼠及小鼠進行類過敏試驗，證明了Beagle犬為類過敏反應的最佳實驗動物，結果準確可靠。

綜上，Beagle犬由于其發(fā)生類過敏反應時出現與人類極為相似的行為學癥狀及生理指標的改變，敏感性高、重復性好，其作為類過敏反應臨床前評價研究的動物模型得到一致認可。

1.2 小型豬模型：

小型豬作為動物實驗模型的相關報道不多，有研究表明其對脂質體引起的補體激活最為敏感。Dezsi等【8】通過對小型豬及大鼠靜脈注射脂質體，發(fā)現均出現補體系統(tǒng)的激活，但小型豬的敏感性明顯大于大鼠。Szebeni等【9】通過實驗發(fā)現微量的脂質體即可引發(fā)小型豬的類過敏癥狀，表現為肺動脈高壓、全身低血壓、心輸出量減少和心律失常等 Beagle犬的血流動力學相關變化近似于小型豬。

因此，Beagle犬和小型豬相比于大鼠而言更適合用于脂質體的類過敏反應檢測，但相比之下小型豬更敏感。綜上，小型豬可作為脂質體類過敏反應檢測的最佳動物模型。

1.3 豚鼠模型：

藥物過敏反應中最常用的動物模型即為豚鼠模型。梁愛華等【2】以豚鼠為受試動物，以含0.4%伊文思藍的去吐溫魚腥草蒸餾液、不同濃度吐溫及含不同濃度吐溫的魚腥草注射液為受試藥物，靜脈注射3.0ml/kg，觀察其30分鐘內行為學變化及耳廓藍染情況。該研究證實豚鼠發(fā)生類過敏反應的主要特征為耳廓血管通透性增高，且與藥物劑量呈現依賴關系，但其未表現出臨床出現的典型的類過敏反應癥狀。陳素珍等【9】通過對豚鼠及小鼠一次性注射中藥注射劑，觀察到了豚鼠明顯的如豎毛、抓鼻、舔足、搔癢及步態(tài)不穩(wěn)等類過敏樣癥狀，小鼠則未觀察到異常。李春英等【10】通過對豚鼠靜脈一次性注射不同濃度吐溫及含不同濃度吐溫的中藥注射劑，發(fā)現其血管通透性增高，且呈現劑量依賴關系。閆位娟等【7】對豚鼠一次性均靜脈注射生理鹽水、吐溫80及多種中藥注射劑，給藥劑量為人臨床應用劑量的6倍，通過行為學特征及血漿組胺水平綜合判斷類過敏反應。結果顯示，豚鼠對中藥注射劑的類過敏反應不明顯，說明用豚鼠做類過敏試驗與人體不完全符合，不夠理想。

綜上，對于豚鼠作為類過敏反應評價的建議各不一致，但基于血管通透性的研究均認為其可作為類過敏反應研究的動物模型，至于豚鼠能否作為類過敏反應臨床前評價的動物模型有待更多更深入的研究加以驗證。

1.4 大鼠模型：

大鼠作為類過敏反應的動物模型亦有相關研究。Dezsi等【8】研究證明大鼠對于脂質體的敏感性很小，不建議大鼠作為脂質體的類過敏反應檢測模型。張立波等【11】以SD大鼠為動物模型，以C48/80為工具藥，對大鼠皮膚類過敏試驗的適用性和可靠性進行研究。結果以皮膚藍斑直徑及藍斑浸出液OD值為檢測指標進行判斷，發(fā)現其作為類過敏反應監(jiān)測具有敏感性好，結果可信的特點。因此，SD大鼠可以作為類過敏反應臨床前評價的動物模型?？道桁o等【12】利用前者的大鼠皮膚類過敏試驗方法實驗方法對臨床常用的一些造影劑、化學合成藥物及中藥注射劑進行檢測，發(fā)現此方法敏感性高，且檢測結果與給藥劑量具有相關性，建議此方法可用于藥物類過敏反應的臨床前評價研究。汪懷山等【13】以MABP（平均動脈血壓）為觀測指標，觀察大鼠一次性靜脈推注組胺及類過敏陽性物質后發(fā)生類過敏反應的敏感程度。結果顯示，大鼠MABP指標指示類過敏反應的發(fā)生具有很好的敏感性，可以以大鼠MABP為觀察指標，將大鼠作為類過敏反應臨床前評價的動物模型。梁愛華等【14】以C48/80為陽性藥對大鼠進行皮膚類過敏試驗，靜脈注射伊文思藍，將藍斑直徑及伊文思藍滲出量為指標來判斷，并用臨床上報道較多的兩種中藥注射劑進行了驗證。結果顯示，此方法驗證的結果與臨床報道具有一致性，且此方法敏感、可靠，因此，以藍斑直徑及伊文思藍滲出量為指標的大鼠皮膚類過敏試驗方法可用于類過敏反應的臨床前評價。

綜上，大鼠作為類過敏反應評價的動物模型主要是皮膚類過敏試驗，通過觀察藍斑直徑、伊文思藍滲出量及MABP等指標來判斷是否發(fā)生類過敏反應，結果顯示敏感性良好。因此，也可將大鼠皮膚類過敏試驗用于類過敏反應的臨床前檢測及評價。

1.5 小鼠模型：

小鼠具有多樣性的分子生物學和免疫學特點，經常用于過敏及類過敏反應的臨床前研究。張宇實等【15】通過對兩種性別的四種小鼠靜脈注射含有伊文思藍的中藥注射劑誘發(fā)類過敏反應，來考察不同品系及性別的小鼠發(fā)生類過敏反應情況。結果顯示，ICR小鼠的敏感性優(yōu)于BALB / C、昆明和 C57品系的小鼠，且普遍顯示雄性小鼠的敏感性優(yōu)于雌性，但相關機制尚不清楚，建議選用雄性ICR小鼠作為類過敏反應的動物模型進行類過敏反應的臨床前評價。謝家駿等【16】通過對小鼠靜脈注射C48/80及吐溫80，觀察其行為學特征及測定血液組胺、β-氨基己糖苷酶及類胰蛋白酶等指標，建立了小鼠全身類過敏試驗方法。并通過中藥注射劑及造影劑進行了驗證，得到了與臨床具有一致性的結果。因此，此方法可用于類過敏反應臨床前檢測及評價。梁愛華等【17】以小鼠為受試動物，一次性靜脈注射含0.4%的伊文思藍陽性對照物質組胺和C48/80，發(fā)現小鼠出現較為明顯的血管通透性增高，且呈現劑量依賴性，說明小鼠主要的類過敏反應特征為血管通透性增高。該研究還利用臨床上報道發(fā)生類過敏反應較多的多種中、西藥注射劑加以驗證，發(fā)現此方法用于類過敏反應的評價敏感性高，臨床一致性好。李春英等【10】以吐溫80、含不同濃度吐溫-80的魚腥草蒸餾液和雙黃連粉針劑一次性靜脈注射給與小鼠，發(fā)現給藥后均未見小鼠全身的異常反應，但耳廓血管反應明顯，且呈現劑量依賴性。因此，可利用小鼠血管通透性增加的特點對臨床上的類過敏反應進行檢測和評價。閆位娟等【7】對小鼠一次性尾靜脈注射陽性物質及中藥注射劑，通過觀察小鼠行為異常及組胺含量變化進行綜合判斷。結果顯示，小鼠由于個體小，行為表現不典型，認為觀察不準確等容易導致誤判。因此，作者認為小鼠作為類過敏反應檢測的動物模型不理想。

綜上，對于小鼠作為評價類過敏反應的動物模型，將血管通透性作為評價指標的研究結果大多認為敏感性及臨床一致性較好。將行為學異常及組胺作為評價指標的研究報道不一，有待進一步研究。

2 體外細胞實驗研究：

隨著科學的進步和動物福利保護呼聲的日益高漲，替代或減少整體動物實驗勢在必行，體外細胞實驗相比整體動物實驗更簡單易行。目前應用于類過敏方向研究的細胞主要有大鼠嗜堿性白血病細胞（RBL-2H3）、小鼠肥大細胞瘤細胞（P815）、人外周嗜堿性白血病細胞（Ku812）和大鼠腹腔肥大細胞（RPMC）等。不同細胞模型有各自特點，下面逐一進行贅述。

2.1 RBL-2H3模型：

RBL-2H3細胞是從Wistar大鼠保持腫瘤狀態(tài)的嗜堿性白血病細胞中分離出來的，其包質內含有很多嗜堿性顆粒，當細胞發(fā)生過敏或類過敏反應時會引起細胞脫顆?，F象，進而釋放組胺和β-氨基己糖苷酶等物質，通過這些物質對過敏及類過敏反應進行判斷。羅霞等【18】將臨床報道出現類似過敏樣反應較多的幾種中藥注射劑與RBL-2H3細胞于體外共同培養(yǎng)，通過細胞計數及測量組胺等相關指標進行判斷，提示RBL-2H3細胞有應用于類過敏反應臨床前評價的潛在價值。熊克朝等[29]將不同濃度C48/80方法分別與RBL-2H3細胞作用不同時間，通過檢測組胺、類胰蛋白酶和β-氨基己糖苷酶的釋放率及細胞活力發(fā)現最佳指標為組胺和β-氨基己糖苷酶釋放率，最佳作用時間是30min。因此，可通過此方法對臨床報道較多的易發(fā)生類過敏反應的藥物進行類過敏反應臨床前評價。易娟娟等【20】亦以C48/80為工具藥，對RBL-2H3細胞應用于藥物類過敏反應評價的方法學進行研究。得出RBL-2H3細胞作為體外評價藥物類過敏反應模型具有方便、靈敏和快速的特點，適用于藥物類過敏反應的臨床前評價。范姍姍等【21】亦以C48/80為工具藥，以實時細胞分析技術檢測其對RBL-2H3細胞生長的影響，另通過檢測組胺及β-氨基己糖苷酶釋放率對RBL-2H3細胞脫顆粒情況加以驗證。建立了基于實時細胞分析技術的可用于類過敏反應臨床前評價的細胞模型。

綜上，RBL-2H3細胞作為類過敏反應臨床前評價的體外細胞模型具有操作簡單、結果靈敏等特點，用于類過敏反應的篩查具有可行性，符合動物福利。

2.2 P815和Ku812模型：

P815細胞系小鼠肥大細胞瘤細胞，來源于小鼠肥大細胞系，其可彌補RBL-2H3細胞不完全代表肥大細胞的不足。Ku812細胞系人外周嗜堿性白血病細胞，來源于慢性髓性白血病患者爆發(fā)起外周血建立起的細胞株。李偉等【22】以C48/80為工具藥分別與三種細胞（RBL-2H3、P815、Ku812）共同培養(yǎng)30min和60min，通過測定Annexin V陽性細胞率、β-氨基己糖苷酶釋放率等指標指示類過敏反應的發(fā)生。用聚山梨酯80進行適用性考察，發(fā)現P815和Ku812細胞模型更敏感、穩(wěn)定，適合用于類過敏反應的早期篩選。高婕等【23】通過比較三種細胞（RBL-2H3、P815、Ku812）經C48/80刺激后發(fā)生細胞脫顆粒及相關指標的差異，尋找適合類過敏反應評價的最佳體外細胞模型。結果顯示，P815細胞相比于其他兩種細胞發(fā)生脫顆?，F象速度快、程度更高，提示其具有應用于細胞模型進行類過敏反應臨床前評價的潛在價值。

綜上，目前關于Ku812細胞作為類過敏細胞模型進行類過敏檢測的研究尚不充分，較多研究結果顯示P815細胞更適合作為類過敏反應臨床前評價的體外細胞模型。

2.3 RPMC模型：

RPMC細胞系大鼠腹腔肥大細胞，來源于大鼠腹腔，具有肥大細胞生物學特征，彌補了P815細胞代表肥大細胞的不足。關于RPMC細胞的研究相對較少，但研究結果較為一致，均認為RPMC細胞可作為類過敏反應臨床前評價的體外細胞模型，但反應細胞脫顆粒的方式有的選用細胞的形態(tài)改變，有的選用β-氨基己糖苷酶等生化指標，具體哪一種方法更能準確的反映細胞脫顆粒情況有待進一步研究。

3 總結與展望：

隨著中藥注射劑臨床應用的日益廣泛，其發(fā)生的不良反應備受關注，其中類過敏反應尤為突出。迄今為止，尚無統(tǒng)一的類過敏反應檢測模型，本文對過去幾年對整體動物及體外細胞實驗模型的研究進行了綜述，旨在為臨床預防類過敏反應的發(fā)生提供指導。

整體動物實驗研究中發(fā)現：Beagle犬能夠表現出與人類極為相似的行為學癥狀及極為敏感的生化指標，普遍認為Beagle犬模型是用于類過敏反應評價的最佳模型 小型豬由于對脂質體敏感，建議用于對脂質體的類過敏反應進行檢測 關于豚鼠和小鼠行為學特征及生化指標的報道結果不一，有待進一步研究，但其血管通透性實驗結果一致，且呈現劑量依賴性，建議豚鼠和小鼠基于血管通透性的研究可用于類過敏反應監(jiān)測的模型 關于大鼠研究較多的是皮膚類過敏試驗，結果敏感性好，可作為類過敏反應臨床前評價的實驗動物模型。

體外細胞實驗研究中發(fā)現：幾乎所有研究認為RBL-2H3細胞作為類過敏反應臨床前評價的體外細胞模型具有操作方便、敏感型好，易實施，符合動物福利 Ku812細胞相關研究較少，有待開展更多研究 有研究認為P815細胞在發(fā)生類過敏反應時生化指標變化快，且敏感，適合用作類過敏反應臨床前評價的體外細胞模型 RPMC細胞相關研究亦不多，但均認為其可作為類過敏反應臨床前評價的體外細胞模型，但因該細胞很難分離純化，用生化指標來反映細胞脫顆粒率會有較大誤差，建議用細胞形態(tài)改變間接計算細胞脫顆粒率。

總之，不同模型檢測指標可能不同，敏感性可能不同，適用范圍也可能不同。因此，需開展更多、更深入的研究，確定類過敏反應發(fā)生的途徑及機制，盡快找到能夠更穩(wěn)定、更準確的用于類過敏反應臨床前評價的實驗模型，促進中藥注射劑發(fā)展的同時減少臨床用藥中類過敏反應的發(fā)生。