DLPME-HPLC法同時(shí)測(cè)定人血清中維生素A和維生素E含量

張小敏 王潔 王淑靜 朱佳佳

摘要：目的 ?建立分散液相微萃取（DLPME）-高效液相色譜（HPLC）同時(shí)測(cè)定人血清中維生素A、E含量的方法。方法 ?2018年5月隨機(jī)抽取人血液樣本50例，經(jīng)DLPME技術(shù)處理后，采用HPLC對(duì)人血清中維生素A、E含量進(jìn)行檢測(cè)，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。結(jié)果 ?維生素A標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=13225x+410.03，相關(guān)系數(shù)為0.9998，檢出限為0.042 μg/ml;維生素E標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1383.9x-458.27，相關(guān)系數(shù)為0.9997，檢出限為0.096 μg/ml。維生素A和維生素E的加標(biāo)回收率分別為90.12%～103.70%和81.09%～92.21%，含量范圍分別為（0.62±0.04）μg/ml和（8.41±0.43）μg/ml。結(jié)論 ?DLPME-HPLC法操作簡便，節(jié)約試劑，對(duì)樣本富集效率高，通過該方法的研究，對(duì)微量血清中維生素A和維生素E的測(cè)定具很好的的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：分散液相微萃取;高效液相色譜;人血清;維生素A;維生素E

中圖分類號(hào)：R151.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.20.051

文章編號(hào)：1006-1959（2019）20-0161-03

Simultaneous Determination of Vitamin A and Vitamin E in Human Serum by DLPME-HPLC

ZHANG Xiao-min，WANG Jie，WANG Shu-jing，ZHU Jia-jia

Abstract：Objective ?To establish a method for simultaneous determination of vitamin A and E in human serum by dispersive liquid phase microextraction （DLPME）-high performance liquid chromatography （HPLC）. Methods ?In May 2018， 50 human blood samples were randomly selected. After treatment with DLPME technique， the contents of vitamin A and E in human serum were detected by HPLC and quantified by standard curve method.Results ?The standard curve of vitamin A was y=13225x+410.03， the correlation coefficient was 0.9998， the detection limit was 0.042 μg/ml; the standard curve of vitamin E was y=1383.9x-458.27， the correlation coefficient was 0.9997， and the detection limit was 0.096 μg/ml. The recoveries of vitamin A and vitamin E were 90.12%～103.70% and 81.09%～92.21%， respectively， and the contents ranged from （0.62±0.04）μg/ml and （8.41±0.43）μg/ml.Conclusion ?DLPME-HPLC method is easy to operate， saves reagents， and has high efficiency of sample enrichment. The research of this method has a good application value for the determination of vitamin A and vitamin E in trace serum.

Key words：Dispersive liquid phase microextraction;High performance liquid chromatography;Human serum;Vitamin A;Vitamin E

維生素（vitamin）是生物體所需要的微量營養(yǎng)成分，維生素A和維生素E是維持人體正常代謝功能所必須的維生素，在自身體內(nèi)無法自行合成，需要通過飲食等手段獲得[1]。維生素A和維生素E均屬于脂溶性的醇類物質(zhì)，維生素A可維持上皮細(xì)胞的正常代謝，促進(jìn)免疫球蛋白的合成;維生素E能夠抑制脂肪酸的氧化，減少脂褐質(zhì)的形成，并保護(hù)細(xì)胞免受自由基的損害，具有抗衰老、保護(hù)皮膚等作用[2]。日常生活中，人體對(duì)維生素的需要量較小，常以毫克或微克計(jì)算，但一旦缺乏就會(huì)引發(fā)相應(yīng)的維生素缺乏癥，對(duì)人體健康造成損害。因此，測(cè)定人血清中維生素A和維生素E對(duì)于維生素缺乏診斷具有重要意義。分散液相微萃取-高效液相色譜（DLPME-HPLC）是一新型前處理技術(shù)，該方法及采樣、萃取和濃縮為一體，具有操作簡單、快速、效率低等特點(diǎn)。本文主要建立DLPME-HPLC同時(shí)測(cè)定人血清中維生素A、E含量的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料 ?2018年5月于寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院隨機(jī)抽取正常學(xué)生體檢血液樣本50例，其中男25例，女25例，年齡22～27歲，平均年齡（23.60±1.40）歲。

1.2儀器與試劑 ?高效液相色譜儀（D2000，日立），C18反相色譜柱（依利特C18 ODS柱，4.6 mm×25 cm，5.0 μm），同類型保護(hù)柱;WH-0微型漩渦混合儀;臺(tái)式高速離心機(jī)（日立）。維生素A（視黃醇）標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma，>99%），維生素E標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma，>95%）;二氯甲烷（色譜純）、三氯甲烷（色譜純）;甲醇（色譜純），實(shí)驗(yàn)用水為優(yōu)普超純水（18.25 MΩ·cm）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件 ?色譜柱為依力特C18反相色譜柱;流動(dòng)相為甲醇∶水=98∶2;流速為0.8 ml/min，柱溫為50℃;紫外檢測(cè)波長：維生素A最佳吸收波長為325 nm，維生素E最佳吸收波長為290 nm。采用日立D-2000液相色譜儀完成，應(yīng)用切換波長程序，實(shí)現(xiàn)維生素A、維生素E的同時(shí)測(cè)定。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)樣品制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ?①標(biāo)準(zhǔn)樣品制備：分別用甲醇配置維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/ml），維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（2 mg/ml）于-20℃冰箱冷藏保存;維生素A和維生素E混合標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（維生素A：1 μg/ml，維生素E：5 μg/ml）：測(cè)定前，對(duì)維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度進(jìn)行標(biāo)定，再以其實(shí)際濃度用甲醇稀釋成混合液。②標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取維生素A和維生素E的混合液，通過控制色譜儀進(jìn)樣體積，分別進(jìn)樣2、5、10、20 μl，維生素A和維生素E的標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖1。

1.4樣品的處理和測(cè)定 ?測(cè)定前取樣品20 μl至200 μl EP管里，加入50 μl甲醇溶液作為蛋白沉淀劑，漩渦混勻后，加入萃取劑，三氯甲烷50 μl、超聲發(fā)生波萃取4 min，以10000 r/min離心5 min，吸取底部萃取液，使用0.45 μm的濾膜過濾之后，按色譜設(shè)置條件進(jìn)行測(cè)定。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 ?采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，人血清樣本維生素A和維生素E含量以（x±s）表示。

2結(jié)果

2.1條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1萃取劑的選擇 ?本實(shí)驗(yàn)選取了三氯甲烷和二氯甲烷做微萃取劑進(jìn)行萃取效果對(duì)比，二氯甲烷萃取效率高但穩(wěn)定性差，三氯甲烷萃取效率極高同時(shí)較為穩(wěn)定，故本實(shí)驗(yàn)最終選取三氯甲烷做微萃取劑。

2.1.2萃取體積的選擇 ?本實(shí)驗(yàn)選取了10、20、30、50 μl三氯甲烷相同條件下萃取樣品，萃取劑體積為20 μl和40 μl時(shí)，萃取效率偏低，且不穩(wěn)定;萃取劑量達(dá)到50 μl時(shí)，萃取效率穩(wěn)定且達(dá)到了分析要求，因此選擇三氯甲烷萃取劑的體積為50 μl。

2.2維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)曲線分析 ?本實(shí)驗(yàn)條件下，維生素A標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=13225x+410.03，相關(guān)系數(shù)為0.9998，檢出限為0.042 μg/ml;維生素E標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1383.9x-458.27，相關(guān)系數(shù)為0.9997，檢出限為0.096 μg/ml，見圖2。

2.3維生素A和維生素E回收率結(jié)果 ?維生素A和E的加標(biāo)回收率分別為90.12%～103.70%和81.09%～92.21%，見表1。

2.4方法精密度測(cè)定 ?取8份同一血清樣品，每份20 μl，按樣本處理方法處理后，上機(jī)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算方法的精密度，結(jié)果顯示，維生素A RSD為6.23%，維生素E RSD為4.81%。

2.5樣本含量測(cè)定 ?按照樣品測(cè)定方法操作，共測(cè)定血清樣本50例，維生素A含量范圍為（0.62±0.04）μg/ml，維生素E含量范圍為（8.41±0.43）μg/ml。

3討論

血清中維生素的測(cè)定是一項(xiàng)較為重要的檢測(cè)內(nèi)容，對(duì)維生素的測(cè)定，不僅能夠?qū)θ粘Ｉ钪芯S生素的補(bǔ)充有指導(dǎo)作用，同時(shí)也為很多疾病的診斷提供了依據(jù)[3]。目前，關(guān)于血清中維生素測(cè)定方法主要有液-液萃取、固相萃取、濁點(diǎn)萃取等，定量分析方法主要有高效液相色譜法、質(zhì)譜法、酶免疫測(cè)定法等，然而常規(guī)樣品的前處理技術(shù)通常比較繁瑣耗時(shí)，需要較多有機(jī)溶劑，分析成本大，同時(shí)對(duì)樣品量要求較大，樣本前處理時(shí)間較長，影響分析的準(zhǔn)確性，在微量血清維生素含量測(cè)量時(shí)難以準(zhǔn)確分析。DLPME-HPLC技術(shù)是近年來新興的一種樣品處理技術(shù)，既保持了萃取溶劑用量小、靈敏度高、環(huán)境污染小等特點(diǎn)，又縮短了萃取時(shí)間，提高了分析效率[4]。因此該技術(shù)在藥物分析領(lǐng)域，尤其是生物樣品前處理中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)在利用分散液相微萃取技術(shù)處理樣本時(shí)，通過對(duì)三氯甲烷和二氯甲烷做微萃取劑進(jìn)行萃取效果對(duì)比，最終選擇三氯甲烷作為萃取劑，其主要原因是樣本處理過程中因三氯甲烷容易揮發(fā)，有利于在低溫環(huán)境中進(jìn)行。另外，萃取時(shí)，漩渦混勻的力度和時(shí)間應(yīng)盡量保持一致，該步驟對(duì)提取效率和精密度有一定的影響。通過對(duì)維生素A、維生素E測(cè)定的色譜條件的優(yōu)化，得到了對(duì)兩種脂溶性維生素測(cè)定的最佳色譜條件，由于維生素A最佳吸收波長為325 nm，維生素E最佳吸收波長為290 nm，為達(dá)到維生素測(cè)定的準(zhǔn)確性，應(yīng)用切換波長程序，波長切換時(shí)基線波動(dòng)較小，對(duì)兩種維生素測(cè)定準(zhǔn)確性無影響。同時(shí)，色譜柱柱溫的高低對(duì)測(cè)定樣本的保留時(shí)間、峰寬、峰形上都有一定的影響，且柱溫對(duì)維生素A和維生素E的影響不同，在流速均為1 ml/min，流動(dòng)相均為甲醇∶水=98∶2時(shí)，柱溫達(dá)到30～60℃時(shí)，維生素A隨柱溫的升高峰面積逐漸增大，并在60℃時(shí)達(dá)最大，而維生素E峰面積受柱溫的影響不大。由于柱溫過高可縮短柱壽命，同時(shí)等度洗脫時(shí)，溫度過高，保留時(shí)間太短，不利于樣本的分離[5]，因此本實(shí)驗(yàn)選擇柱溫為50℃。最終，本實(shí)驗(yàn)按照樣品測(cè)定方法操作，共測(cè)定血清樣本50例，維生素A含量范圍為（0.62±0.04）μg/ml，維生素E含量范圍為（8.41±0.43）μg/ml。因不同人種和人群有較大差異，加上所測(cè)樣品數(shù)量較少，所以本法檢測(cè)數(shù)據(jù)不能代表正常人全血中維生素A和E的含量水平，僅供參考。

總之，DLPME-HPLC法操作簡便，節(jié)約試劑，對(duì)樣本富集效率高，通過該方法的研究，對(duì)微量血清中維生素A和維生素E的測(cè)定具很好的的應(yīng)用價(jià)值。

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收稿日期：2019-5-27;修回日期：2019-6-20

編輯/杜帆