加味不忘散對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響?

李曉瓊，何玲玲，劉曉蕾，李新毅

(山西醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，太原 030032)

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是一種不可逆的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，約占老年癡呆的50%～75%，臨床癥狀主要表現(xiàn)為記憶認(rèn)知功能的進(jìn)行性減退或伴有人格和情感控制等方面的損害[1]，其病理特征主要包括β淀粉樣蛋白(Aβ)聚集形成的淀粉樣斑塊即老年斑，以及tau蛋白過(guò)度磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元不同程度的丟失和膠質(zhì)細(xì)胞活化造成的炎癥介質(zhì)釋放[2]。目前AD發(fā)病機(jī)制仍未明確，近年來(lái)越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，Aβ沉積誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與AD發(fā)生發(fā)展[3]。據(jù)國(guó)際阿爾茨海默病協(xié)會(huì)(ADI)2016年公布的數(shù)據(jù)，全世界有4.7×107例癡呆患者，預(yù)計(jì)到2050年這一數(shù)字將增加到1.31×108以上[4]。目前國(guó)內(nèi)AD患者人數(shù)已高達(dá)800萬(wàn)人之多,這為人類(lèi)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)負(fù)擔(dān)[5]，因此阿爾茨海默病的防治已成為全世界關(guān)注的熱點(diǎn)。本課題組先前研究提示，加味不忘散可以改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。本次研究在之前研究基礎(chǔ)上探討其對(duì)AD模型大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)的影響及其發(fā)揮作用的可能機(jī)制，為中藥治療AD患者提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

選取8周雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(275±25)g，由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。環(huán)境溫度為21±1 ℃，濕度適宜，每天12 h光照/12 h 黑暗，自由進(jìn)食進(jìn)水。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、低劑量及高劑量組4組，各組大鼠數(shù)量分別為7、8、7、8只。低劑量及高劑量組分別給予低濃度及高濃度加味不忘散，而假手術(shù)組、模型組給予蒸餾水。4組大鼠均灌胃給藥(每日1次，1 ml/100 g)，連續(xù)給藥20 d。本次實(shí)驗(yàn)已通過(guò)山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

加味不忘散組成：遠(yuǎn)志20 g，人參、熟地黃各15 g，茯神、當(dāng)歸、白術(shù)各10 g，石菖蒲、黃連各5 g，共計(jì)100 g(具體劑量基于徐淑云編寫(xiě)的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[6])，制成免煎顆粒共22 g。加味不忘散溶液：加味不忘散低濃度 0.15 g/ml(3.67 g免煎顆粒+111 ml煮沸的水)和高濃度0.30 g/ml(7.33 g免煎顆粒+111 ml煮沸的水)。

1.3 主要試劑

Aβ1-42：濃度2 μg/μL，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒：美國(guó)Merck-Calbiochem；ELISA試劑盒：上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.4 動(dòng)物模型制備及驗(yàn)證

模型組：將大鼠用10% 水合氯醛麻醉，固定于立體定位儀；用碘伏棉球消毒手術(shù)區(qū)，在大鼠頭頂中間部皮膚作一縱切口，剝離皮下組織，用10% H2O2清潔顱骨表面的肌肉和筋膜并剝離，用顱骨鉆雙側(cè)顱骨鉆孔，定位前囟后3.84 mm，旁開(kāi)2.2 mm，顱骨下2.5 mm(參考包新民等編寫(xiě)的《大鼠腦立體定位圖譜》)[7]，雙側(cè)海馬緩慢注射Aβ1-42(2.5 μl/側(cè))，注射完成留針5 min后局部清潔消毒縫合頭項(xiàng)皮膚，傷口局部注射適量慶大霉素以預(yù)防感染；假手術(shù)組：除雙側(cè)海馬注射等量生理鹽水外，余與模型組相同。

模型驗(yàn)證：造模14 d后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，大鼠學(xué)習(xí)記憶功能減退者即為造模成功，之后對(duì)造模成功的模型組大鼠連續(xù)灌胃給藥20 d。

1.5 觀(guān)察海馬組織結(jié)構(gòu)及海馬神經(jīng)元凋亡情況

灌胃結(jié)束后用10%水合氯醛麻醉大鼠，用4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注，于冰塊上迅速取出海馬后進(jìn)行石蠟包埋，分別用HE染色、TUNEL觀(guān)察海馬組織結(jié)構(gòu)及海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡情況。

1.6 檢測(cè)血清及海馬炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量

血清采集：使用采血針刺入左室心尖處搜集；海馬組織：用10%水合氯醛麻醉大鼠，斷頭取腦后迅速分離雙側(cè)海馬制備海馬勻漿，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)炎癥因子含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬組織形態(tài)學(xué)改變

圖1顯示，假手術(shù)組海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，未見(jiàn)到壞死的神經(jīng)元；模型組海馬神經(jīng)元細(xì)胞可見(jiàn)形態(tài)異常，結(jié)構(gòu)疏松，排列紊亂，可觀(guān)察到胞核固縮；低劑量組和高劑量組海馬神經(jīng)元細(xì)胞較模型組均有不同程度改善。

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.低劑量組；D.高劑量組圖1 各組大鼠海馬組織HE染色比較(×400)

2.2 各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡比較

表1圖2顯示，假手術(shù)組海馬組織內(nèi)凋亡細(xì)胞(即TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞)數(shù)極少，模型組較假手術(shù)組相比可見(jiàn)到大量的凋亡細(xì)胞(P<0.0001)，低劑量組與模型組相比未見(jiàn)凋亡細(xì)胞數(shù)減少(P>1.0)，高劑量組較模型組凋亡細(xì)胞數(shù)減少(P=0.01)，而低劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)明顯差異(P=0.12)。提示Aβ1-42可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，低濃度加味不忘散未能改善海馬神經(jīng)元凋亡情況，高濃度加味不忘散可以在一定程度上改善Aβ1-42所致的海馬神經(jīng)元凋亡。

2.3 各組大鼠血清及海馬組織炎癥因子水平比較

表1顯示，4組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示加味不忘散并不影響血清炎癥因子水平。

表1 各組大鼠血清炎癥因子水平、海馬TUNEL陽(yáng)性率及炎癥因子水平比較

注:與假手術(shù)組比較:*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較:#P<0.05,##P<0.01;與低劑量組比較:△P<0.05

注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.低劑量組；D.高劑量組圖2 各組大鼠海馬組織TUNEL染色比較(×100)

表1顯示，海馬組織中IL-1β模型組較假手術(shù)組水平增加(P<0.0001)，低劑量組較模型組比較并未降低(P=0.80)，高劑量組較模型組水平降低(P<0.0001)，高劑量組較低劑量組水平降低(P=0.01)；海馬組織中IL-6模型組較假手術(shù)組水平增加(P<0.0001)，低劑量組較模型組比較并未降低(P=0.60)，高劑量組較模型組水平降低(P=0.001)，高劑量組與低劑量組比較未降低(P=0.24)；海馬組織中TNF-α模型組比較假手術(shù)組水平增加(P<0.0001)，低劑量組、高劑量組較模型組水平降低(P=0.02，P<0.0001)，高劑量組較低劑量組相比未減少(P=0.23)。提示Aβ1-42增加了海馬組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平，而低濃度加味不忘散能夠降低TNF-α水平，但未能降低IL-1β及IL-6水平，高濃度加味不忘散可以減弱Aβ1-42所致的IL-1β、IL-6、TNF-α水平增加。

3 討論

AD作為老年癡呆最常見(jiàn)的原因，其發(fā)病與年齡相關(guān)，隱匿起病，病程發(fā)展緩慢且不可逆，臨床主要表現(xiàn)為近記憶力損害[4]。目前AD病因機(jī)制不明，主要包括Aβ神經(jīng)毒性學(xué)說(shuō)、tau蛋白學(xué)說(shuō)、中樞膽堿能機(jī)制及越來(lái)越受到重視的神經(jīng)炎癥機(jī)制[4]。AD屬于中醫(yī)學(xué)“呆病”范疇[8]，其中腎虛腦髓失養(yǎng)是其基本病機(jī)[9]。目前FDA用于批準(zhǔn)治療AD的藥物僅能改善患者的生存質(zhì)量，對(duì)AD病程的進(jìn)展及患者的長(zhǎng)期預(yù)后并無(wú)顯著影響。近年來(lái)，針對(duì)AD主要病理特征Aβ及tau蛋白免疫治療因其不可避免的副作用尚未達(dá)到預(yù)期效果[10]。

結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)藥理論基礎(chǔ)以及AD相關(guān)基礎(chǔ)研究，中藥在AD治療方面的優(yōu)勢(shì)為防治AD提供了一個(gè)新的思路。有研究表明，中藥單體姜黃素、丹參素及何首烏等[11]以及中藥復(fù)方開(kāi)心散、腦靈湯等[12]在AD臨床治療方面確實(shí)存在一定療效，因此關(guān)于中藥治療AD的研究受到人們來(lái)越多的關(guān)注。

有研究發(fā)現(xiàn)，古方不忘散可以改善雌激素缺乏AD大鼠模型認(rèn)知功能損害，并降低海馬組織炎癥反應(yīng)[13]。加味不忘散是在不忘散基礎(chǔ)上增加熟地黃、當(dāng)歸、白術(shù)、黃連4味中藥而成，組方較前更加科學(xué)合理。本課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)，加味不忘散可以改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，說(shuō)明加味不忘散的神經(jīng)保護(hù)作用[14]。

神經(jīng)元細(xì)胞大量丟失是AD典型的病理特征之一，神經(jīng)元丟失是以細(xì)胞凋亡形式出現(xiàn)[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，Aβ能夠誘導(dǎo)腦內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[16]，然而其具體機(jī)制仍未明確。此外，神經(jīng)炎癥反應(yīng)同樣在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，尤其是在疾病早期階段，膠質(zhì)細(xì)胞活化啟動(dòng)的惡性循環(huán)會(huì)促使炎癥因子釋放和神經(jīng)元損害[17]。盡管有些臨床研究顯示AD患者癥狀略有改善，但非甾體抗炎藥的療效在總體上并不樂(lè)觀(guān)[18]。近年來(lái)，中藥復(fù)方的基礎(chǔ)研究[19]體現(xiàn)出中藥在抗AD神經(jīng)炎癥反應(yīng)方面的優(yōu)勢(shì)。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組海馬神經(jīng)元凋亡及炎癥反應(yīng)較其他組嚴(yán)重，低、高劑量組海馬神經(jīng)元凋亡數(shù)量較其余3組有改善，高劑量組同樣可以減少Aβ1-42所致的IL-1β、IL-6、TNF-α釋放，而低劑量組上述作用不明顯。這可能是因?yàn)锳β1-42誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)生，同時(shí)高濃度加味不忘散對(duì)神經(jīng)元凋亡及神經(jīng)炎癥反應(yīng)有效。在本次實(shí)驗(yàn)中尚未對(duì)AD模型大鼠神經(jīng)炎癥指標(biāo)與AD病理學(xué)標(biāo)志物(如Aβ)之間的關(guān)系進(jìn)行探討，在以后的研究中將會(huì)進(jìn)一步探索加味不忘散對(duì)AD大鼠神經(jīng)炎癥相關(guān)通路及其與AD典型病理學(xué)標(biāo)志物關(guān)系的影響，以期為AD的治療提供一個(gè)新的策略。

綜上所述，加味不忘散可以抑制Aβ1-42誘導(dǎo)AD大鼠模型海馬炎癥因子釋放及神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，提示加味不忘散可能通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)發(fā)揮其神經(jīng)元保護(hù)作用。