下丘腦胰島素抵抗在多囊卵巢綜合征排卵障礙中的作用

馬玲，劉振華，陳皓，劉鳳 (長江大學第一臨床醫學院 荊州市第一人民醫院內分泌科，湖北 荊州 434000)

易清華 (長江大學第一臨床醫學院 荊州市第一人民醫院婦產科，湖北 荊州 434000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是由卵巢泡膜細胞良性增生引起的高雄激素血癥、持續性排卵障礙和卵巢多囊性改變為主要特征的臨床疾病，一般在青春期前后發病[1]。PCOS是導致育齡期婦女不孕的最常見原因之一，患病率為5%～10%[2]。該病臨床表現為月經異常、肥胖等，并有高脂血癥、糖尿病等多種代謝并發癥，伴有明顯的胰島素抵抗(IR)[3]。國內外臨床研究證實，PCOS患者中，50%～60%存在IR。1980年Burghen等首次提出IR參與PCOS的發病過程[4]。有醫者研究通過生活方式干預與胰島素增敏劑(如二甲雙胍與TZD藥物)治療PCOS患者后，其能量代謝得以改善，同時卵巢排卵率也有一定程度的提高[5]。由此，學者們推測PCOS胰島素水平升高不僅是患者能量代謝紊亂的標志信號，也是導致患者排卵障礙的關鍵環節[6,7]。臨床上治療效果顯示，改善機體能量代謝、降低胰島素水平能夠在一定程度上提高PCOS的排卵生殖力，但作用十分有限，治療效果并不理想[8]。最近研究發現，下丘腦胰島素受體后IRS2/PI3K/AKT信號傳導受阻(即下丘腦胰島素抵抗)將導致機體胰島素分泌增加[9]。筆者擬通過硫酸普拉睪酮鈉誘導構建PCOS大鼠模型，探究PCOS大鼠是否也存在下丘腦胰島素抵抗，以及改善下丘腦胰島素抵抗能否降低PCOS胰島素水平、促進卵巢排卵，并研究PCOS大鼠下丘腦胰島素受體底物(IRSs)、PI3K、AKT2mRNA的影響，從而闡明下丘腦胰島素抵抗在多囊卵巢綜合征排卵障礙中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SD雌性大鼠為研究對象，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。50只大鼠均為3周齡，體重180～200g。

1.2 模型建立

將大鼠適應性飼養1周后， 頸背部皮下注射硫酸普拉睪酮鈉溶液，9mg/100g，連續注射20d。該組大鼠在實驗周期內均給予高脂飼料喂養。計算胰島素敏感指數(insulin sensitivityindex, ISI)：

篩選造模組中ISI小于正常組ISI的均值減1.96標準差、且陰道涂片無周期變化者作為成模大鼠 ,即為造模成功[10]。正常組(24只)：頸背部皮下注射等量溶劑(共20d)，實驗周期內該組大鼠均給予普通飼料喂養。

1.3 分組與給藥

選擇24只造模成功的SD大鼠，隨機分為2組：模型對照組(12只)不進行任何給藥處理；模型激活組(12只)連續皮下注射1.1μg/kg胰島素樣生長因子(IGF-1)，8周。

將正常組大鼠24只，隨機分為2組：正常對照組(12只)不進行任何給藥處理。抑制組(12只)大鼠每日腦室內灌注0.7mg/kg的P13K阻滯劑渥曼青霉素(Wortmannin)和11.2mg/kg的AKT抑制劑哌立福辛(Perifosine)，連續8周[11]。

1.4 體重和胰島素及脂質代謝測定

實驗結束后，各組大鼠均禁食12h，然后采用0.3mL/100g的10%水合氯醛進行腹腔注射以麻醉大鼠。腹主動脈取血后，室溫下(25℃±2℃)靜置20min，然后4℃離心機中3500r/min離心10min。采用相應試劑盒分別檢測血清中游離脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)和總膽固醇水平(TC)。

1.5 下丘腦中IRS-2含量測定[12]

上述大鼠頸椎脫臼處死后，于冰上剝取下丘腦。采用4%多聚甲醛進行固定，固定時間24h。然后采用手術刀將目的部位組織修整平，進行乙醇梯度脫水后，采用石蠟進行包埋并切片(4μm)，每個下丘腦隨機選取4張切片進行IRS-2含量測定。60℃烘烤切片后，采用二甲胺和乙醇脫蠟至水。隨后組織切片采用EDTA抗原修復緩沖液(pH9.0)進行微波爐抗原修復10min。自然冷卻后，采用PBS(pH7.4)洗滌3次，5min/次。

采用3%過氧化氫溶液阻斷組織中內源性過氧化物酶(20min)后，分別加入一抗(1∶500，5%BSA)和HRP標記的二抗，分別孵育過夜和50min。采用DAB顯色后Harris蘇木素復染3min，1%鹽酸酒精分化數秒后氨水返藍。最后采用乙醇梯度脫水后，采用中性樹膠封片。

切片200×拍照后，采用軟件Image-ProPlus6.0對照片分析，得出每張照片陽性的積累光密度(IOD值)，代表IRS-2含量。

1.6 下丘腦中PI3K和p-PI3K蛋白表達的測定[13]

1.6.1 總蛋白的提取

取各大鼠下丘腦組織1mm3，采用冷TBS洗滌2～3次后，采用10倍體積的下丘腦組織試劑(含蛋白酶抑制劑：非磷酸化/磷酸化蛋白酶抑制劑)冰上勻漿。冰浴30min后，10000r/min離心5min。收集上清，即下丘腦組織總蛋白溶液，備用。

1.6.2 Western Blot測定下丘腦中PI3K和p-PI3K蛋白表達

采用Bradford法進行蛋白濃度的測定。以牛血清白蛋白為標準品進行標準曲線的繪制。測完蛋白含量后，計算含40μg蛋白的溶液體積即為SDS-PAGE電泳的上樣量。

轉膜后，分別使用5%脫脂牛奶(溶劑為0.5%TBST)和5%脫脂牛奶(溶劑為5%BSA)進行非磷酸蛋白和磷酸化蛋白的檢測。一抗和二抗加入后，分別4℃過夜和室溫30min孵育。最后采用顯影和定影試劑進行顯定影。拍照后，采用Alpha凝膠圖像分析軟件進行目標條帶的光密度值。

1.7 下丘腦中AKT2mRNA檢測表達

取100mg下丘腦組織，加入1mL Trizol Reagent進行勻漿。然后加入250μL三氯甲烷，靜置后10000r/min離心10min(4℃)。取上清，加入0.8倍體積的異丙醇，-20℃靜置15min后，10000r/min離心10min(4℃)。棄去上清，采用1.5mL 75%乙醇洗滌后，吹干。反轉錄后，采用定量PCR測定AKT2基因的表達情況。

1.8 排卵生殖力檢測

摘取各組大鼠雙側卵巢，用4%多聚甲醛固定，采用石蠟包埋并切片后，HE染色，采用顯微鏡觀察。計算各組大鼠排卵率、平均排卵數和囊性擴張卵泡率[14]:

(1)

(2)

(3)

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠體重和空腹血胰島素水平測定結果

大鼠體重測定結果匯總如表1所示。由表1可以看出，模型對照組即多囊卵巢綜合征大鼠，體重顯著性大于其他各組大鼠(P<0.05);抑制組即PI3K和AKT抑制組大鼠，相同培養時間時其體重顯著性高于正常對照組(P<0.05);模型激活組的體重顯著性低于模型對照組和抑制組(P<0.05)，但是明顯高于正常對照組(P<0.05)。

表1 各組大鼠的體重

實驗開始后每2周測定大鼠的空腹血胰島素水平，測定結果匯總如表2所示。由表2可以看出，正常對照組和模型激活組的大鼠空腹胰島素水平隨著時間推移并無統計學差異(P>0.05);模型對照組即多囊卵巢綜合征大鼠，隨著時間推移，血胰島素水平升高(P<0.05)，且顯著高于其他各組大鼠(P<0.05);抑制組即PI3K和AKT抑制組大鼠，相同培養時間時其血胰島素顯著性高于正常對照組(P<0.05);模型激活組的血胰島素顯著性低于模型對照組和抑制組(P<0.05)，恢復到正常對照組血胰島素水平，與正常對照組并無統計學差異(P<0.05)。

表2 各組大鼠空腹胰島素水平

2.2 大鼠脂質代謝水平

實驗結束后，各組大鼠均禁食12h后取動脈血測定脂質代謝，測定結果匯總如表3所示。由表3可以看出，抑制組、模型對照組和模型激活組的大鼠TC、TG、FFA均高于正常對照組(P<0.05);模型對照組大鼠TC、TG、FFA則均高于抑制組和模型激活組(P<0.05);抑制組大鼠TC、TG、FFA均顯著性高于模型激活組(P<0.05)。

表3 各組大鼠的脂質代謝檢測結果

2.3 大鼠下丘腦中IRS-2含量測定

實驗結束后，各組大鼠下丘腦中IRS-2累積光密度值情況如下：正常對照組2802.76±225.88、抑制組1492.48±116.37、模型對照組277.55±633.14、模型激活組1736.49±185.49。抑制組、模型對照組和模型激活組的大鼠下丘腦中IRS-2均低于正常對照組(P<0.05)；模型對照組下丘腦中IRS-2低于抑制組和模型激活組(P<0.05)；抑制組大鼠下丘腦中IRS-2低于模型激活組(P<0.05)。

2.4 大鼠下丘腦中PI3K和p-PI3K蛋白表達的測定

實驗結束后，各組大鼠下丘腦中PI3K和p-PI3K相對于β-actin的表達量測定結果匯總如表4所示。由表4可以看出，抑制組、模型對照組和模型激活組的大鼠下丘腦中PI3K/β-actin和p-PI3K/β-actin均低于正常對照組(P<0.05)；模型對照組大鼠下丘腦中PI3K/β-actin和p-PI3K/β-actin低于抑制組和模型激活組(P<0.05)；抑制組大鼠下丘腦中PI3K/β-actin和p-PI3K/β-actin低于模型激活組(P<0.05)。

2.5 大鼠下丘腦中AKT2mRNA檢測

實驗結束后，各組大鼠下丘腦中AKT2mRNA測定結果匯總如表4所示。由表4可以看出，抑制組、模型對照組和模型激活組的大鼠下丘腦中AKT2mRNA均低于正常對照組(P<0.05)；模型對照組大鼠下丘腦中AKT2mRNA低于抑制組和模型激活組(P<0.05)；抑制組大鼠下丘腦中AKT2mRNA低于模型激活組(P<0.05)。

表4 各組大鼠下丘腦中PI3K、p-PI3K蛋白和AKT2mRNA表達

2.6 大鼠排卵生殖力

實驗結束后，各組大鼠排卵生殖力測定結果匯總如表5所示。由表5可以看出，抑制組、模型對照組和模型激活組的大鼠平均排卵數和排卵率均低于正常對照組(P<0.05);模型對照組大鼠平均排卵數和排卵率低于抑制組和模型激活組(P<0.05);抑制組大鼠平均排卵數和排卵率低于模型激活組(P<0.05);抑制組、模型對照組和模型激活組的大鼠囊性擴張卵泡率高于正常對照組(P<0.05);模型對照組大鼠囊性擴張卵泡率高于抑制組和模型激活組(P<0.05);抑制組大鼠囊性擴張卵泡率高于模型激活組(P<0.05)。

表5 各組大鼠排卵生殖力

3 討論

下丘腦PI3K是參與細胞內信號轉導的信號分子之一[15]。下丘腦PI3K催化亞基的正常表達可生成PIP2和PIP3，作用于PI3K信號通路下游的各種酶，保證了胰島素代謝功能的正常實現[16]。AKT是作為PI3K信號通路上重要的下游分子，參與實現對機體糖代謝調解過程[17]。胰島素受體底物(IRSs)是胰島素信號轉導通路受體后水平的重要信號蛋白。其中IRS-2參與胰島素在中樞下丘腦的傳遞過程，可以影響PI3K信號通路對胰島素的傳導[18]。筆者以SD雌性大鼠為研究對象，頸背部皮下注射硫酸普拉睪酮鈉溶液建立多囊卵巢綜合征大鼠模型。并分為正常對照組、抑制組(Wortmannin和Perifosine阻滯PI3K/AKT通路)、模型對照組和模型激活組(皮下注射1.10μg/kg胰島素一號增長因子IGF-1)。結果發現，模型對照組即多囊卵巢綜合征大鼠，體重、空腹胰島素水平、囊性擴張卵泡率、血清中FFA、TG和TC均大于其他各組大鼠(P<0.05)；抑制組即PI3K/AKT通路抑制組大鼠，相同培養時間時其體重、空腹胰島素水平、囊性擴張卵泡率、血清中FFA、TG和TC均高于正常對照組(P<0.05)；模型激活組的體重、空腹胰島素水平、囊性擴張卵泡率、血清中FFA、TG和TC均低于模型對照組和抑制組(P<0.05)，但是高于正常對照組(P<0.05)；模型對照組即多囊卵巢綜合征大鼠，下丘腦中IRS-2、PI3K/β-actin、p-PI3K/β-actin、AKT2mRNA表達水平、平均排卵數和排卵率均低于其他各組大鼠(P<0.05)；抑制組即PI3K/AKT通路抑制組大鼠，相同培養時間時下丘腦中IRS-2、PI3K/β-actin、p-PI3K/β-actin、AKT2mRNA表達水平、平均排卵數和排卵率均低于正常對照組(P<0.05)；模型激活組的下丘腦中IRS-2、PI3K/β-actin、p-PI3K/β-actin、AKT2mRNA表達水平、平均排卵數和排卵率均高于模型對照組和抑制組(P<0.05)，但是低于正常對照組(P<0.05)。

單純下丘腦胰島素受體后IRS2/PI3K/AKT信號障礙可顯著減輕胰島素對肝糖輸出的抑制作用[19]。下丘腦胰島素受體后IRS2/PI3K/AKT信號傳導受阻(即下丘腦胰島素抵抗)將導致機體胰島素分泌增加，進而引起大鼠下丘腦胰島素抵抗和排卵障礙[20]。對比多囊卵巢綜合征大鼠和IGF-1激活大鼠的各項生理指標，可以看出多囊卵巢綜合征大鼠呈現典型的下丘腦胰島素抵抗和排卵障礙。

綜上所述，下丘腦胰島素受體IRS2/PI3K/AKT信號傳遞在升高對機體胰島素水平與降低排卵生殖力中的作用具有促進作用。