孕中期血性羊水細胞改良培養法質量分析

陳儉輝 趙連芳 景亞玲 李曉紅

【摘要】 目的：探索孕中期血性羊水細胞高效的培養方法。方法：采用普通培養瓶法對46例血性羊水細胞進行培養，并對培養情況進行質量分析。結果：46例血性羊水中45例一次培養成功，1例嚴重新鮮血性羊水培養失敗，培養成功率為97.8%。結論：提高羊水細胞培養成功率，優化血性羊水的培養及收獲條件，能夠為臨床提供準確的產前診斷報告，對指導優生優育、預防出生缺陷具有重要意義。

【關鍵詞】 血性羊水;產前診斷;質量控制

我國是出生缺陷大國，由于人口基數大，每年都有80～120萬出生缺陷兒降生，目前沒有特異性的治療手段，只有通過實時的產前診斷和出生干預才能做到出生缺陷防控[1]。染色體病是出生缺陷最常見的原因，當前診斷的金標準就是染色體核型分析。血性羊水標本會嚴重影響羊水細胞的培養，所以提高血性羊水的培養成功率能有效地減輕孕婦重新穿刺的痛苦，也能提高產前診斷效率。本研究通過對46例血性羊水標本培養方法進行改良研究，提高了血性羊水的培養成功率。

1資料與方法

1.1研究資料

2017年1月至2018年12月，在本院產前診斷中心咨詢，因有各種高危產前診斷指征接受羊水穿刺的46例血性羊水孕婦，孕婦孕周17～25周。

1.2方法

1.2.1標本收集穿刺孕婦在了解羊水穿刺風險和相關注意事項后，簽署知情同意書，完成穿刺前檢查血常規、凝血功能、血型、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等。B超下觀察胎盤位置，羊水量及深度，確定穿刺部位，并做好記錄，無菌條件下穿刺取羊水細胞20mL，記錄羊水性狀（顏色、渾濁度等）分裝2瓶，送實驗室。穿刺術后孕婦留院觀察30min，無異常反應并告知術后注意事項后離院。

1.2.2培養新鮮血性羊水應及時送往實驗室，離心，去上清，剩約1.0～1.5mL，重懸細胞沉淀，接種到25cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養7d，換液處理，在原培養瓶加入2mL新鮮培養液培養加入新鮮羊水培養液2mL。同時將培養瓶中上清倒入新的標記培養瓶中，加入2mL新鮮培養液繼續靜置培養7d后觀察。對于克隆島較少的樣本，在無菌條件下，先將上清進行換液處理，再用細胞刮刮取貼壁細胞，然后加入新鮮培養液培養。繼續培養1～2d后觀察。換液后每天觀察細胞生長情況，當羊水細胞貼壁生

作者簡介：陳儉輝（1988-），男，碩士，臨床檢驗師。研究方向：產前診斷與遺傳病診斷

*趙連芳為本文通訊作者

長旺盛，鏡下見多個克隆和適量圓形、雙圓形透明細胞時可收獲。收獲前1d換1次新鮮培養液，使細胞營養充足。加入濃度20μg/mL的秋水仙素100μL，混勻，繼續培養4h后制備。

1.2.3制備將培養液轉移到15mL的離心管中。用細胞刮刮取收集羊水細胞，再用0.9%的氯化鈉溶液清洗1～2次，并轉移到離心管中。1600r離心10 min，棄上清。加入0.075mol/L KCL溶液8mL，混勻，37℃低滲8min。然后加入固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）2mL，混勻預固定5min，1600r離心10min，棄上清。再加入固定液8mL，混勻，固定，1600r離心10min。重復固定1次。離心后根據細胞沉淀量加入新鮮固定液調懸，然后在25℃、55%濕度環境將細胞懸液滴于干凈的玻片上，放置30min。置60℃烤箱2h。

1.2.4G顯帶配置0.025%胰酶溶液，37℃水浴30min后，消化染色體片（不同季節試片后確定消化時間）。0.9%的氯化鈉溶液內漂洗后Giemsa染色，風干。

1.2.5核型分析將顯帶染色體片置于全自動掃描儀下掃描，統計中期數目。每例計數30個分裂相，分析5～10個核型。嵌合型核型加倍分析。根據《人類細胞遺傳學國際命名體制》（ISCN2013）的標準描述染色體異常核型。

1.3統計學分析

采用統計軟件SPSS 13.0對數據進行分析，克隆數等計數資料以率表示。

2結果

2.1羊水細胞培養成功率

46例血性羊水中35例為新鮮血性，樣本占76.09%，11例為陳舊血性，樣本占23.91%。45例一次培養成功，1例嚴重新鮮血性羊水培養失敗，總成功率為97.8%（45/46）。

2.2培養細胞克隆數例

初次培養新鮮血性羊水長勢較差，細胞克隆數較少;陳舊血性羊水長勢相對較好，克隆數稍多。換液轉種培養后出現相反的趨勢，新鮮血性羊水克隆數稍豐富，陳舊血性羊水克隆數稍少。生長克隆數如表1所示。

3討論

羊水穿刺染色體核型分析是目前染色體病診斷的金標準，但是一種創傷性的診斷方法，穿刺經過胎盤，就容易使羊水受到血細胞的污染[23]，大量的血細胞容易包裹羊水細胞，使羊水細胞不易聚集貼壁生長[4]，所以建立血性羊水細胞的培養和收獲標準也是診斷所需。

首先，對于新鮮血性羊水在采集到樣本后，一定要及時送往實驗室離心，避免血液凝集過程中將活性羊水細胞包裹，如發現血液污染嚴重，可以加入1滴無菌肝素溶液，輕輕混勻。羊水接種培養7d后，觀察生長情況，對于嚴重血性羊水進行半量換液，其他樣本均全量換液，所有換出來的液體轉移到新的培養瓶中加入新鮮培養液繼續培養。細胞克隆豐富的樣本只需加入新鮮培養液培養，待處于分裂旺盛期時加入秋水仙素收獲。對于克隆島較少的樣本，換液后進行傳代培養。由于胰酶的消化時間不容易把握，且影響細胞的貼壁生長，采用細胞刮輕輕刮取貼壁生長細胞[5]，然后加入新鮮培養液培養2d后，會有大量小的細胞克隆，然后換液處理，加速細胞生長，則能收獲到大量羊水細胞。實驗中發現新鮮血液羊水換液培養的長勢比初次培養較好，可能是因為紅細胞活性的降低和凝血因子等物質活性下降，抑制作用降低，羊水細胞能夠進行貼壁生長所致[67]。

陳舊血性羊水主要是孕婦在穿刺之前出現過出血狀況，污染了羊水，經過一段時間的吸收后會呈現出棕色或褐色，離心后能看到褐色紅細胞[8]。通過實驗處理來看，陳舊血性羊水對羊水細胞的貼壁生長影響稍小，初次培養后，羊水克隆普遍多于新鮮血性羊水，可能是因為凝血因子等物質活性下降的原因。而再次培養時長勢稍差，可能是因為初次培養活性細胞貼壁生長，上清活性細胞少。

羊水培養染色體核型分析是一個相對較為繁瑣的實驗，每個實驗步驟都可能影響最終的結果[9]。而血性羊水的處理會比常規處理更為繁瑣，培養時與環境交流更多，所以嚴格控制實驗的無菌操作也是保證成功的前提，把握實驗過程中的質量控制，合理完善操作規程以及優化的實驗條件是制作出高質量的染色體片的保證，才能為臨床提供準確的分析結果[10]。

綜上所述，改良的血性羊水培養方法和羊水細胞收獲流程，能夠有效地提高血性羊水的培養成功率，能夠避免孕婦二次穿刺的痛苦，具有較強的實際應用價值。

參考文獻

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