丁酸鈉與小檗堿聯合改善C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病

張艷玲，蔣建東，孔維佳

(中國醫學科學院北京協和醫學院 1. 醫藥生物技術研究所病毒室,2. 藥物研究所天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的病程包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)和肝纖維化，如不加以有效控制，可能會發展成肝硬化和肝癌[1]。NAFLD目前無特異性藥物治療，主要治療方法包括降血脂、減肥、胰島素增敏和保肝等[1]。

丁酸鈉(sodium butyrate，NaB)是丁酸的可溶性鈉鹽。丁酸是一種短鏈脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA)，在牛奶中富含，并可由腸道菌發酵膳食纖維而產生。研究發現[2-3]，其在動物體內具有改善糖脂代謝、減肥、抗炎、抗氧化、防治腫瘤等有益作用。小規模臨床研究也證明，富含丁酸的食物能改善人體糖脂代謝，并抑制體質量增加[2]。丁酸對飲食誘導的大鼠NAFLD有明顯改善作用，能明顯減輕肝臟脂肪蓄積和肝纖維化[2]。小檗堿(berberine，BBR)是一種異喹啉類生物堿，提取自黃連和黃柏等植物，長期以來，一直用于腹瀉的治療，近年來，也被用于臨床治療高脂血癥[4]。大量基礎和臨床研究表明，其對人體內分泌代謝、循環、消化和神經系統的多種慢性疾病有一定改善作用，是一種有廣泛臨床應用價值和前景的天然藥物[4]。BBR對NAFLD有明確的改善作用，如在動物模型中，BBR明顯減少肝臟脂肪含量，減輕肝組織炎癥反應和氧化應激[5]。臨床研究也發現，BBR明顯減少NAFLD患者的肝臟脂肪含量，并改善肝功能[6]。由于丁酸與BBR對NAFLD均有改善作用，因此，我們推測二者聯合應用可能進一步減輕NAFLD。目前，NaB與BBR聯合用于改善NAFLD的作用尚未見文獻報道，因此，本文以高脂飼料(high-fat diet，HFD)誘導了小鼠的NAFLD模型，并研究NaB與BBR的聯合作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑NaB和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒，購自美國Sigma-Aldrich公司；BBR購自阿拉丁試劑(上海)有限公司。血清膽固醇(cholesterol，CHO)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、甘油三酯(tyiglyceride，TG)、丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測試劑盒，購自北京中生北控生物科技有限公司；組織CHO和TG檢測試劑盒，購自北京普利萊基因技術有限公司；AMP依賴的蛋白激酶α(AMP-activated protein kinase α,AMPKα)、磷酸化AMPKα(p-AMPKα)(Thr172)、β-actin的兔源單克隆抗體，購自美國Cell Signaling Technology公司；蛋白提取、定量和ECL試劑盒，購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；細胞和組織總RNA提取試劑盒，購自德國QIAGEN公司；反轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR Master Mix，購自美國Promega公司；PCR引物，由美國Invitrogen公司合成；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)檢測試劑盒，購自上海碧云天生物技術有限公司；異氟烷，購自北京友誠嘉業生物科技有限公司。

1.2 實驗動物♂SPF級6周齡C57BL/6J小鼠50只，體質量(18.7±1.48)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號為SCXK(京)2007-0001。飼養環境為中國醫學科學院醫藥生物技術研究所實驗動物房，室溫(20～24) ℃，自由飲水，12 h明暗循環。

1.3 方法

1.3.1動物實驗 實驗方案由中國醫學科學院醫藥生物技術研究所倫理委員會審核并批準。所有動物適應性喂養3 d后，隨機分為5組，每組10只。其中一組繼續以基礎飼料(normal diet，ND)喂養作為正常對照，其余動物投喂HFD(購自北京華阜康生物科技股份有限公司，成分為60% kcal脂肪、20% kcal蛋白質、20% kcal碳水化合物)。以HFD喂養的動物共4組，分別為生理鹽水(normal saline，NS)組、NaB 200 mg·kg-1組、BBR 100 mg·kg-1組、NaB 200 mg·kg-1+ BBR 100 mg·kg-1組。NaB以NS溶解，BBR以NS制成混懸液，于每日10 ∶00 am進行灌胃給藥。給藥與HFD投喂同時進行，持續7周，每周測量1次小鼠體質量和攝食量。

1.3.2肝臟1H磁共振波譜(magnetic resonance spectroscopy，MRS)檢測和分析 給藥6周后，每組隨機選5只小鼠進行肝臟1H MRS檢測。動物禁食12 h后，在Matrx VIP3000吸入式麻醉機(美國Matrx公司)中，以3%異氟烷誘導麻醉，并以1.5%異氟烷維持麻醉，然后以PharmaScan70/16 US小動物磁共振成像儀(德國Bruker公司)進行檢測，具體方法和參數與文獻報道一致[7]。檢測后，使用MestReNova軟件分析波譜信號，根據文獻報道的公式[7-8]計算肝臟脂肪酸的多不飽和指數(polyunsaturation index，PUI)和不飽和指數替代物(surrogate unsaturation index，UIs)。飽和指數(saturation index，SI)的計算方法為1-UIs[8]。

1.3.3血清、肝臟標本收集和測定 實驗結束前1 d晚上，所有動物禁食12 h，摘眼球取血，室溫靜置2 h后，以2 000×g離心20 min，吸取血清轉移至新離心管，以相應試劑盒測定血脂和肝功能等血清生化指標。

頸椎脫位處死小鼠后，取肝臟稱重，并計算肝指數：肝指數=肝質量/體質量(實驗后)×100。取肝臟左葉于4%甲醛中固定，石蠟(5 μm)及冰凍(8 μm)切片后，分別進行HE和油紅O(oil red O，ORO)染色并照相。剩余肝臟放入液氮中迅速冷凍，隨后轉移至-80 ℃冰箱保存。勻漿后以試劑盒測定肝組織中CHO、TG、SOD、T-AOC和MDA的含量或水平，并以蛋白濃度進行校正。

1.3.4Western blot 肝組織勻漿后，以試劑盒測定蛋白濃度，取含25 μg蛋白的樣品進行SDS-PAGE。以電轉法(240 mA，2 h)將蛋白轉移至PVDF膜上，封閉后，與AMPKα或β-actin的單抗4 ℃孵育過夜，洗膜后，與HRP標記的二抗室溫孵育1 h，再次洗膜后，以ECL試劑盒顯色并拍照。然后，以抗體洗脫液處理含AMPKα的膜以移除抗體，膜與p-AMPKα單抗和HRP標記的二抗孵育后，再次顯色檢測信號。以Gel-Proanalyzer凝膠定量分析軟件掃描條帶灰度，再以AMPKα為參照，對p-AMPKα的表達量進行校正，結果以ND組的倍數表示。

1.3.5實時熒光定量反轉錄-PCR 肝組織勻漿后，以試劑盒提取總RNA，定量后，取1 μg作為模板進行反轉錄，反應體系(15 μL)參考文獻報道[9]，條件為25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。然后利用基因特異性引物(Tab 1)和ABI 7500 FAST實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)對cDNA進行擴增，反應體系(25 μL)參考文獻報道[9]，條件為95 ℃ 2 min，40個循環：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。以GAPDH為內參，對目的基因的循環閾值(cycle threshold，Ct)進行校正，并以ΔΔCt法對目的基因mRNA的表達進行相對定量分析，結果以ND組的倍數表示。

Tab 1 Primers for real-time PCR(5’→3’)

2 結果

2.1 NaB與BBR聯合對NAFLD小鼠血脂、肝功能和體質量增加的影響以HFD喂養7周后，C57BL/6J小鼠出現高脂血癥(Tab 2)，表現為血清CHO、LDL-C和TG水平較ND組明顯升高(P<0.01)。200 mg·kg-1的NaB或100 mg·kg-1的BBR單獨應用，可使血脂水平明顯降低(P<0.05)；與NaB或BBR單獨應用比較，二者聯合時降血脂效果更為明顯(P<0.05)。HFD誘導小鼠發生肝功能損害，表現為血清ALT和AST水平明顯升高(P<0.01)。NaB或BBR單獨應用可使肝功能明顯改善(P<0.05)，與NaB或BBR單獨應用比較，二者聯合應用可使肝功能基本恢復正常(P<0.05)。

HFD+NS組小鼠平均攝食量較ND組明顯減少(P<0.05)，而以HFD喂養的各組動物間攝食量沒有差異(Tab 3)。實驗結束時，HFD+NS組小鼠體質量增加值較ND組明顯增加(P<0.01)；與HFD+NS組比較，NaB或BBR單獨應用組小鼠體質量增加值明顯減少(P<0.05)；NaB與BBR聯合應用時，小鼠體質量增加值基本恢復正常(與HFD+NS比P<0.01)，且效果較二者單獨應用更為明顯(P<0.01)。

2.2 NaB與BBR聯合對NAFLD小鼠肝臟脂肪蓄積和脂肪酸組成的影響如Tab 3所示，HFD+NS組小鼠的肝組織CHO、TG水平以及肝指數較ND組明顯升高(P<0.01)，NaB或BBR單獨應用可使這些指標明顯降低(P<0.05)，二者聯合應用時這些指標進一步改善并幾乎恢復到正常水平(與HFD+NS組比P<0.01，與NaB或BBR單獨應用比P<0.05)。 肝臟切片和HE染色顯示，ND組小鼠肝組織結構正常，ORO染色僅見少量散在的紅染脂滴；HFD+NS組小鼠肝索結構紊亂，出現明顯脂肪變性，表現為肝細胞氣球樣變和空泡樣變，并有點狀壞死，ORO染色出現大量紅染脂滴并有融合現象；NaB或BBR單獨應用能使這些病理改變得到明顯改善；二者聯合時能使HFD誘導的肝組織病理改變基本恢復正常(Fig 1、2)。

Tab 2 Effects of NaB, BBR, or their combination on serum biochemical indexes in HFD-fed C57BL/6J n=10)

**P<0.01vsND;#P<0.05,##P<0.01vsHFD+NS;△P<0.05vsHFD+NaB or HFD+BBR

Tab 3 Effects of NaB, BBR, or their combination on food intake, body weight gain, liver index and lipids

*P<0.05,**P<0.01vsND;#P<0.05,##P<0.01vsHFD+NS;△P<0.05,△△P<0.01vsHFD+NaB or HFD+BBR

肝臟1H MRS分析顯示(Fig 3)，HFD使小鼠肝臟脂肪酸的組成發生改變，表現為PUI和UIs明顯減少，而SI明顯增加(P<0.01)。NaB或BBR單獨應用可使這些指標明顯改善(P<0.05)，二者聯合時小鼠肝臟PUI和UIs進一步增加，而SI進一步減少(與HFD+NS組比P<0.01，與NaB或BBR單獨應用比P<0.05)。

2.3 NaB與BBR聯合對肝臟AMPK通路、脂肪合成和分解基因表達的影響如Fig 4A所示，HFD+NS組小鼠肝臟AMPK信號通路受到抑制，表現為p-AMPKα(Thr172)水平較ND組明顯降低(P<0.01)。NaB或BBR單獨應用明顯激活肝臟APMK通路(P<0.05)，二者聯合應用效果更為明顯，使肝臟p-AMPKα(Thr172)水平基本恢復正常(與HFD+NS組比P<0.01，與NaB或BBR單獨應用比P<0.05)。

與ND組比，HFD+NS組小鼠肝臟脂肪合成基因如脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)和硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1)的mRNA表達水平明顯增加(P<0.01)，而脂肪分解基因如肉毒堿棕櫚酰基轉移酶1A(carnitine palmitoyltransferase 1A，CPT1A)和酰基輔酶A氧化酶1(acyl-CoA oxidase 1，ACOX1)的mRNA表達水平明顯減少(P<0.01)。NaB或BBR單獨應用明顯下調FAS和SCD1的表達，并上調CPT1A和ACOX1的表達(P<0.05)。NaB與BBR聯合應用效果更為明顯，使肝臟脂肪合成和分解基因的表達基本恢復正常(與HFD+NS組比P<0.01，與NaB或BBR單獨應用比P<0.05)(Fig 4B)。

2.4 NaB與BBR聯合對肝臟炎癥因子表達和氧化應激的影響如Fig 5所示，HFD+NS組小鼠肝臟白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等炎癥因子的mRNA表達水平較ND組明顯升高(P<0.01)，同時出現氧化應激反應，表現為肝組織的SOD活力和T-AOC明顯減少，而MDA含量明顯增加(P<0.01)。NaB或BBR單獨應用明顯減少炎癥因子的表達，并抑制氧化應激(P<0.05)，二者聯合應用效果更明顯，使上述指標基本恢復正常(與HFD+NS組比P<0.01，與NaB或BBR單獨應用比P<0.05)。

Fig 1 Effects of NaB, BBR, or their combination on liver HE staining in HFD-fed C57BL/6J mice(×200)

Fig 2 Effects of NaB, BBR, or their combination on liver ORO staining in HFD-fed C57BL/6J mice(×200)

Fig 3 Effects of NaB, BBR, or their combination on liver PUI (A), UIs (B) and SI (C) in HFD-fed C57BL/6J n=5)

**P<0.01vsND;#P<0.05,##P<0.01vsHFD+NS;△P<0.05vsHFD+NaB or HFD+BBR

Fig 4 Effects of NaB, BBR, or their combination on liver AMPKα phosphorylation (A) and mRNA expression levels of lipogenic and lipolytic genes (B) in HFD-fed C57BL/6J n=10)

**P<0.01vsND;#P<0.05,##P<0.01vsHFD+NS;△P<0.05vsHFD+NaB or HFD+BBR

Fig 5 Effects of NaB, BBR, or their combination on liver mRNA expression levels of inflammatory factors (A), SOD (B),T-AOC (C) and MDA (D) in HFD-fed C57BL/6J n=10)

**P<0.01vsND;#P<0.05,##P<0.01vsHFD+NS;△P<0.05vsHFD+NaB or HFD+BBR

3 討論

本文首次報道了NaB與BBR聯合，改善HFD誘導的C57BL/6J小鼠NAFLD的作用。丁酸與BBR在生物體內存在內在聯系。BBR口服給藥后吸收差，在腸道中濃度很高，能調控腸道菌群，使SCFA產生菌在腸道中富集，從而明顯增加丁酸等SCFA的產生[10-11]。在體內腸道菌產生的丁酸可進入血液循環，到達靶器官后，可能與BBR產生聯合作用從而調控代謝[11]。

與文獻報道二者單獨應用時的效果[2, 4-6]相一致，本文的結果顯示，200 mg·kg-1的NaB與100 mg·kg-1的BBR聯合應用于HFD喂養的小鼠7周，具有明顯的降血脂、抑制體質量異常增加、減少肝臟脂肪蓄積、改善肝臟脂肪酸組成和減輕肝功能損害的作用。進一步實驗發現，NaB與BBR聯合明顯激活小鼠肝臟AMPK通路，抑制脂肪合成，促進脂肪分解，并且明顯減輕肝組織的炎癥反應和氧化應激。NaB與BBR聯合應用的效果和活性明顯優于二者單獨應用，并且達到藥理學的相加作用，說明NaB與BBR聯合能進一步改善脂代謝，并減輕HFD誘導的小鼠NAFLD。我們的研究結果為將來NaB與BBR聯合應用于臨床治療NAFLD等代謝性疾病提供了科學依據。

NaB與BBR調控脂代謝和改善NAFLD的機制均與AMPK的活化有關[2-4]。AMPK是細胞物質和能量代謝的關鍵分子，激活后具有抑制合成代謝和促進分解代謝的作用[12-13]。本文的結果與文獻報道一致，NaB與BBR聯合應用能進一步激活AMPK通路，增加其磷酸化水平，抑制脂肪合成并促進脂肪分解，從而進一步減少肝臟脂肪蓄積，抑制體質量的異常增加。分子和細胞水平的機制研究發現，NaB通過活化細胞肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)來激活AMPK[2-3]，而BBR則通過抑制細胞線粒體呼吸鏈和ATP合成來增加AMP：ATP的比率，并激活AMPK[4]。二者聯合應用時，對這些細胞信號通路以及線粒體的影響目前未知，需深入研究。

1H MRS檢測顯示，HFD喂養使小鼠肝臟PUI和UIs明顯減少，而SI明顯增加，說明NAFLD小鼠肝臟脂肪酸組成發生了病理性改變，不飽和脂肪酸明顯減少，而飽和脂肪酸明顯增加。與肝臟TG測定和ORO染色結果一致，NaB與BBR聯合明顯減少肝臟SI，而增加PUI和UIs，使這些指數基本恢復到ND組的正常水平。提示NaB與BBR聯合應用能使NAFLD小鼠肝臟的脂肪酸組成發生有益改變，使飽和脂肪酸明顯減少，而不飽和脂肪酸明顯增加。

炎癥反應和氧化應激在NAFLD的病程進展中發揮重要作用，尤其對肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化、肝纖維化和肝硬化的發展非常關鍵[14-15]。本文結果顯示，NaB與BBR聯合具有很強的抗炎和抗氧化活性，提示該聯合方案對肝纖維化和肝硬化可能具有抑制作用，后續研究將側重于該方向。NaB與BBR的抗炎抗氧化作用涉及多條細胞信號通路，如核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor-2，Nrf2)通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路等[2, 4]。NaB與BBR聯合用于改善NAFLD時，對這些細胞信號通路的影響需要進行深入研究。

綜上所述，本文的研究證明，NaB與BBR聯合用于HFD誘導的C57BL/6J小鼠NAFLD能進一步激活AMPK通路，減少肝臟脂肪蓄積，抑制炎癥反應和氧化應激，并改善肝功能。NaB與BBR的聯合可能具有一定的開發和應用前景。

(致謝：本研究在中國醫學科學院醫藥生物技術研究所病毒室和動物實驗室完成，感謝在實驗過程中給予幫助的所有老師和同學！)