橘紅素對人胃癌AGS細胞自噬的作用及其機制研究

陳圣敏，龔永昌，隋 璐，楚 敏，董 楊

(上海中醫藥大學教學實驗中心，上海 201203)

胃癌是一種較為常見的消化道惡性腫瘤，其發病率位于惡性腫瘤發病率的第5位，死亡率位于第3位[1]。胃癌在我國的發病率很高，嚴重危害著我國人民的身體健康，目前主要的治療方式還是以外科手術切除及化療為主，但是術后復發率高、化療藥物不耐受等問題仍然困擾著許多胃癌患者。有研究表明，進展期胃癌即使接受了手術為主的綜合治療，5年生存率仍低于30%[2]。

天然有效成分仍然是抗腫瘤研究的關注點之一。橘紅素(Tangeretin，Tan)是一種存在于中藥枳實中的多甲氧基黃酮成分，對于多種腫瘤細胞如肺癌、胃癌、結腸癌、乳腺癌等均有一定的抑制作用[3]。前期研究表明，橘紅素可明顯抑制人胃癌AGS細胞的增殖，主要機制可能是通過抑制細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)磷酸化和上調CyclinB1蛋白表達使細胞阻滯于S期和G2/M期[4]。橘紅素還可以通過p53依賴的線粒體途徑和Fas/FasL介導的死亡受體途徑誘導胃癌AGS細胞的凋亡[5]。近期有很多相關研究發現，在胃癌的病變過程中，細胞自噬起到很大的作用[6]。因此，本研究從自噬的角度進一步探究橘紅素對人胃癌AGS細胞的影響，并初步探討其分子機制，為橘紅素防治胃癌提供新的實驗依據。

1 材料

1.1 細胞株人胃癌AGS細胞株購自中科院細胞庫(上海)。

1.2 藥物與試劑橘紅素(純度>98%, 批號：09102121)購自上海同田生物技術有限公司；氯喹(chloroquine，CQ)(批號：#105M4035V)購自美國Sigma公司；雷帕霉素(Rapamycin，Rapa, 批號：53123-889) 購自北京諾特萊斯(Notlas)生物科技有限公司； 0.25%胰酶(批號：1854874)購自美國GIBCO公司；胎牛血清(批號：1706126)購自以色列Biological Industries生物科技公司；HAM’s/F12培養液(批號：AC10256410)購自美國Hyclone公司；ECL plus 顯影試劑盒購自美國Merk Millipore公司；β-actin一抗為美國CST公司產品。

1.3 儀器BD FACS Calibur流式細胞儀(美國)，Sonics超聲細胞破碎儀(美國)，Bio-Rad水平、垂直電泳及轉膜裝置(美國)，Thermo HERA cell 150二氧化碳培養箱，Bio-Rad-Image-Lab凝膠成像分析系統(美國)。

2 方法

2.1 細胞培養人胃癌AGS細胞株接種于含10%胎牛血清的HAM’s/F12培養液，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。

2.2 Western blot檢測蛋白表達收集細胞，加入配制好的RIPA裂解液100 μl，冰上裂解30min，充分裂解后，4 ℃，10 000 rpm，離心10 min，取上清，按BCA試劑盒說明測定蛋白濃度。分別取10～30 μg樣品蛋白/孔上樣，電泳，濕轉60 min(4 ℃，100 V)，5% BSA封閉2 h，然后分別用β-actin、LC3、p62一抗4 ℃平搖過夜，二抗避光孵育1 h， ECL顯色液顯色，Bio-Rad-Image-Lab凝膠成像分析系統拍照，對蛋白條帶進行數據分析，以目標蛋白條帶與β-actin條帶的比值作相對定量，分析各樣品中目標蛋白表達的差別。

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡選擇處于對數生長期的AGS細胞，以1×108個·L-1的密度，2 ml/孔，接種于6孔培養板。貼壁生長12～24 h后，各孔分別加入相應藥物，作用48 h。然后用無EDTA胰酶消化細胞，并收集至離心管內，1 000 rpm離心5 min。棄上清，用冰冷PBS洗滌1次，1 200 rpm離心5min。棄上清，加入稀釋好的1×Buffer混勻并轉移至流式管，繼續1 200 rpm離心5min。棄上清，各樣品管，先加入5 μl Annexin V，再加入5 μl PI，混勻，4 ℃避光，靜置染色20 min。染色后，每管加入1×Buffer 0.5 ml，流式細胞儀檢測分析。

3 結果

3.1 橘紅素對自噬相關蛋白的影響橘紅素作用24 h，可劑量依賴地增強LC3Ⅱ蛋白(P<0.05,P<0.01)和p62蛋白(P<0.05)的表達。作用48h，橘紅素可呈劑量依賴地增強p62蛋白的表達(P<0.05,P<0.01)，對LC3Ⅱ蛋白的表達無明顯影響。見Fig 1。提示橘紅素可以促進自噬體的堆積，抑制自噬體的降解。

3.2 自噬抑制劑CQ的影響作用24 h和48 h，CQ和橘紅素聯合處理(CQ+Tan)組與橘紅素單獨處理(Tan)組比較，LC3Ⅱ和p62蛋白的表達明顯增加(P<0.01)。見Fig 2。提示橘紅素與自噬抑制劑CQ有相似的作用，進一步驗證了橘紅素對AGS細胞自噬主要是抑制作用。

3.3 自噬促進劑Rapa的影響如Fig 3所示，Rapa和橘紅素聯合處理(Rapa+Tan)組與Tan組比較，LC3Ⅱ和p62蛋白的表達均下降(P<0.05)。提示橘紅素對AGS細胞主要不是促進自噬的作用。

3.4 CQ對橘紅素誘導AGS細胞凋亡的影響如Fig 4所示，CQ+Tan組與Tan單獨處理組比較，細胞凋亡率有統計學差異(P<0.01))。該結果提示，橘紅素與CQ具有協同作用，可能通過抑制自噬流促進AGS細胞的凋亡。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.5 橘紅素對Akt蛋白磷酸化的作用如Fig 5所示，不同濃度橘紅素(10、30、60 μmol·L-1)作用24和48 h，Akt蛋白的磷酸化水平均可呈劑量依賴地下降(P<0.05,P<0.01)。以上結果提示，橘紅素可以降低Akt蛋白的磷酸化水平，并具有劑量依賴性。

Fig 2 Effects of CQ on autophagic flux blocked by tangeretin n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vstangeretin group

4 討論

自噬是細胞在饑餓、缺氧或其它應激條件下，

Fig 3 Effects of Rapa on autophagic flux blocked by tangeretin n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vstangeretin group

在自噬相關基因(Autophagy associated gene，Atg)的調控下，利用溶酶體降解受損的細胞器和大分子物質，為細胞自身提供營養的過程。自噬作為一種自我防御途徑，通過防止垃圾或毒素的積累，在特殊情況下有利于腫瘤細胞生存[7]。然而，異常的自噬活性可能導致細胞內蛋白質和細胞器的不適當的降解，最終可以導致細胞自噬死亡[8]。盡管自噬與腫瘤的關系密切又復雜而且有爭議，但近年來，不少研究提示自噬與胃癌的發生、發展及轉移都密切相關,自噬相關蛋白在預測胃癌預后中有潛在臨床意義。因此，深入了解自噬與胃癌的關系，將有助于更好地理解自噬在胃癌中的臨床應用價值。

Fig 4 Effects of CQ on tangeretin-induced apoptosis n=3)

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vstangeretin group

自噬是一個動態連續的過程，包括自噬體的形成，自噬體成熟后與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，同時降解其內容物[9]。近年來，越來越多研究以自噬流來評價自噬的活性[10]。自噬體的形成和消除，是自噬流的兩個十分緊密的過程。LC3蛋白是一種自噬標記物，LC3的C端能夠被Atg4分割成LC3 I，分布在細胞質中。形成自噬體以后，LC3 I能夠和磷脂酰乙醇胺結合，生成LC3 II[11]。p62是選擇性自噬的底物蛋白, 在自噬溶酶體的降解中有著十分重要的作用。當缺少Atg基因或自噬體與溶酶體融合受到阻礙時，p62蛋白會明顯堆積[12]。因此，可以通過檢測p62蛋白的表達量來觀測自噬流。本研究結果發現，橘紅素作用后LC3II和p62蛋白表達均有所增加，表明橘紅素增加了自噬體的堆積，而且自噬體的降解可能是受阻的。為了進一步證明橘紅素有抑制AGS細胞自噬流的作用，又分別檢測了自噬抑制劑CQ和自噬促進劑Rapa的作用。結果表明，CQ可以明顯上調LC3II和p62蛋白表達量，而Rapa則相反，提示橘紅素與CQ作用相似，有抑制AGS細胞自噬流的作用，可能主要是抑制自噬體的降解引起自噬體的堆積。

Fig 5 Effects of tangeretin on Akt phosphorylation n=3)

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

細胞凋亡和自噬雖然是細胞死亡的兩種途徑，但兩者常存在著密切關系，凋亡和自噬常相互作用，在腫瘤發病中發揮作用[13]。前期研究發現，橘紅素有誘導AGS細胞的凋亡的作用，那么橘紅素抑制AGS細胞的自噬流與細胞凋亡是否存在關系呢？本研究觀察了自噬抑制劑CQ與橘紅素聯合作用48 h對人胃癌AGS細胞凋亡率的影響，結果顯示，CQ與橘紅素聯合處理比橘紅素單獨處理，AGS細胞凋亡率明顯增加，提示橘紅素與CQ具有協同作用，可能通過抑制AGS細胞自噬流，促進細胞的凋亡。

Akt又被稱為蛋白激酶B (protein kinase B， PKB)，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的一種，廣泛參與腫瘤細胞的增殖、凋亡和分化等過程的調節[14]?；罨腁kt既可以直接激活mTOR，也可以通過間接途徑，即抑制TSC2和TSC1來激活mTOR，參與自噬[15]。本研究發現，橘紅素作用24 h 和48 h均可以抑制Akt的磷酸化，因此認為，Akt的磷酸化可能參與橘紅素抑制細胞自噬流，促進細胞凋亡的過程。

綜上，橘紅素可能通過阻斷AGS細胞的自噬流，抑制AGS細胞自噬體的降解，造成自噬體的堆積，從而促進細胞的凋亡。Akt蛋白的磷酸化可能參與了這一過程。

(致謝：本研究在上海中醫藥大學教學實驗中心微生物與免疫實驗室完成，在此致以衷心的感謝! )