楊桃根苯醌對(duì)鏈脲佐菌素致糖尿病小鼠糖脂代謝、氧化應(yīng)激和炎癥損傷的影響

覃陸慧，吳興春，周 幸，吳婭妮，黃仁彬，張士軍

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021)

糖尿病是指胰島素絕對(duì)或者相對(duì)不足所導(dǎo)致糖代謝紊亂為主的全身性疾病，同時(shí)引發(fā)脂代謝以及蛋白代謝異常，從而導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)環(huán)境紊亂，繼而引發(fā)組織、器官以及系統(tǒng)病變的一種綜合代謝疾病。糖尿病臨床治療較為棘手，且尚缺乏特異性、針對(duì)性的治療藥物，因此，研究開(kāi)發(fā)有效治療糖尿病的藥物，是目前醫(yī)藥工作者共同努力的方向。

楊桃根(酢漿草科)作為一種極具地方特色的中草藥，是中國(guó)廣西豐富的地道藥用植物資源，民間多將其用來(lái)抗高血糖，治療感冒頭痛，緩解胃病[1-2]。本課題組前期的藥理研究表明：楊桃根總提取物及醇提取物能夠降低糖尿病小鼠的血糖，改善血脂代謝及提高抗氧化能力[3-5]，但楊桃根苯醌治療糖尿病尚未有明確的研究。本研究將以尾靜脈注射STZ建立糖尿病小鼠模型，通過(guò)觀察楊桃根苯醌(benzoquinone ofAverrhoacarambolaL.root，BACR)對(duì)糖尿病小鼠血脂，氧化應(yīng)激能力，炎癥因子及對(duì)TLR4/MyD88/NF-κB蛋白表達(dá)的影響，初步探討B(tài)ACR對(duì)糖尿病小鼠治療作用及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物KM ♂小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量(20±2)g，采購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的環(huán)境中，室溫(18～25) ℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h光照晝夜循環(huán)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXKG桂2014-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：XYKG桂2014-0003。

1.2 藥材與試劑楊桃根苯醌提取物由本課題組自行制備[6]。鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司)；鏈脲佐菌素(STZ，美國(guó)Sigma公司)；總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒，均購(gòu)于上海執(zhí)誠(chéng)生物科技股份有限公司；單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1) 、白介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒，均購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所；Toll樣受體4因子(TLR4)抗體、髓樣分化因子(MyD88)抗體、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)抗體，均購(gòu)于Abcam公司。

1.3 儀器Accu-Chek Performa 型血糖儀(德國(guó)羅氏診斷有限公司)；5810R高速低溫離心機(jī)(艾本德中國(guó)有限公司)；日立7100型全自動(dòng)生化分析儀；BX53正置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；SpectraMaxPius384連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀(香港分子儀器公司)

2 方法

2.1 糖尿病小鼠模型的建立及分組給藥實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，造模前禁食不禁水12 h，隨機(jī)選取10只健康小鼠作為正常組，其余小鼠均尾靜脈注射 STZ 320 mg·kg-1(STZ溶于生理鹽水中，現(xiàn)配現(xiàn)用，冰浴保存)。72 h后進(jìn)行尾靜脈取血，使用羅氏血糖儀測(cè)小鼠空腹血糖(FBG)，選取FBG≥11.1 mmol·L-1者作為糖尿病模型小鼠。將糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍組(320 mg·kg-1)、BACR高、中、低劑量組(120 mg·kg-1、60 mg·kg-1、30 mg·kg-1)，連續(xù)灌胃給藥21 d，正常組和模型組每天給予等量生理鹽水灌胃。并分別于灌胃給藥第0 d、7 d、14 d、21 d將小鼠禁食、不禁水12 h后稱(chēng)體質(zhì)量，將小鼠尾靜脈取血，測(cè)定小鼠空腹血糖。

2.2 指標(biāo)測(cè)定

2.2.1小鼠血清血脂及炎癥因子指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后，小鼠摘除眼球取血，血液自然凝固后于離心機(jī)中3 500 r·min-14 ℃低溫離心10 min，分離上層血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C、MCP-1、IL-1β炎癥因子指標(biāo)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.2肝臟組織指標(biāo)的檢測(cè) 小鼠取材時(shí)摘取出肝臟洗去積血，取適量的肝臟組織加入生理鹽水制備成10%的肝組織勻漿，離心后取上清用于SOD、MDA、GSH-Px的測(cè)定。

2.2.3肝組織病理學(xué)檢測(cè)及免疫組化法檢測(cè) 肝組織通過(guò)10%甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行HE染色，觀察肝組織的病變及免疫組化染色檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 小鼠的一般指標(biāo)給藥21 d后，正常組小鼠毛發(fā)光亮，精神狀態(tài)較好，飲食飲水正常。模型組小鼠毛色灰暗，反應(yīng)遲鈍，多飲多食多尿，體質(zhì)量明顯下降(P<0.01)，墊料潮濕。其余給藥組的小鼠精神狀態(tài)較模型組有所改善，能減輕多飲多食多尿的癥狀，體質(zhì)量較模型組有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)。見(jiàn)Tab 1。

3.2 BACR對(duì)糖尿病小鼠空腹血糖的影響由Tab 2結(jié)果可知，與正常組相比，模型組小鼠的FBG明顯升高(P<0.01)；灌胃給藥21 d后，與模型組比較，BACR高、中、低給藥組小鼠的FBG明顯降低(P<0.01)，說(shuō)明BACR對(duì)改善糖尿病小鼠的高糖狀態(tài)具有一定的作用。

Tab 1 Effects of BACR on body weight in diabetic n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05 ,##P<0.01vsmodel

Tab 2 Effects of BACR on FBG in diabetic n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05 ,##P<0.01vsmodel

Tab 3 Effects of BACR on levels of TC, TG, LDL-C and HDL-C in diabetic mice n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05 ,##P<0.01vsmodel

3.3 BACR對(duì)糖尿病小鼠TC、 TG、LDL-C、HDL-C的影響由Tab 3結(jié)果可知，與正常組相比，模型組的TC、TG、LDL-C明顯升高(P<0.01)，HDL-C明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，BACR 3個(gè)劑量組小鼠的TC、TG明顯降低(P<0.05 或P<0.01)，HDL-C明顯升高(P<0.05 或P<0.01)。BACR高劑量組LDL-C降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，BACR中、低劑量組LDL-C也一定的降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3.4 BACR對(duì)糖尿病小鼠肝組織SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響由Tab 4結(jié)果可知，與正常組相比，模型組小鼠的SOD、GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)，MDA水平明顯升高(P<0.01)；與模型組小鼠比較，BACR可以明顯增高小鼠肝臟SOD、GSH-Px活力，明顯降低MDA含量(P<0.05 或P<0.01)，BACR低劑量組的SOD雖然有所升高，也降低了MDA水平，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tab 4 Effects of BACR on levels of SOD、MDA、 GSH-Px in liver tissues of diabetic mice n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05 ,##P<0.01vsmodel

3.5 BACR對(duì)糖尿病小鼠MCP-1、IL-1β的影響由Tab 5結(jié)果可知，與正常組相比，模型組小鼠的MCP-1、IL-1β含量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，BACR高、中劑量組小鼠的MCP-1、IL-1β含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01)。BACR低劑量組小鼠IL-1β含量有一定下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tab 5 Effects of BACR on level of MCP-1, IL-1β in diabetic mice n=10)

**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.6 BACR對(duì)糖尿病小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響由Fig 1 肝臟HE染色結(jié)果可知，正常組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組小鼠肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)局部壞死，肝索排列紊亂，胞質(zhì)中出現(xiàn)大小不一的脂滴，與周?chē)?xì)胞連接不緊密。二甲雙胍組及BACR 3個(gè)劑量組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)較完整，肝細(xì)胞數(shù)量增多，肝索形狀排列比較清晰，明顯減輕了肝細(xì)胞損傷，改善了糖尿病引起的肝臟病變。

Fig 1 Histological observations of liver tissues (HE staining×400)

A: Normal; B: Model; C: Metformin; D: BACR high dose; E: BACR middle dose; F: BACR low dose

Fig 2 Effects of BACR on expressions of TLR4、MyD88、NF-κB in liver tissues of mice (×400) A: Normal; B: Model; C: Metformin; D: BACR high dose; E: BACR middle dose; F: BACR low dose

3.7 BACR對(duì)糖尿病小鼠肝組織中TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表達(dá)影響由Fig 2及Tab 6肝臟免疫組化結(jié)果可知，與正常組相比，模型組小鼠肝臟組織TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，蛋白表達(dá)主要集中在細(xì)胞核及胞漿。與模型組相比，各給藥組可以明顯下調(diào)小鼠肝臟組織TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白表達(dá)水平(P<0.05 或P<0.01)。

Tab 6 Effects of BACR on expressions of TLR4, MyD88, NF-κB in liver tissues of mice n=10)

*P<0.05,**P<0.01vsnormal;#P<0.05,##P<0.01vsmodel

4 討論

STZ是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲，是目前被公認(rèn)的制備糖尿病小鼠模型的經(jīng)典化學(xué)誘導(dǎo)劑，它對(duì)小鼠的胰島β細(xì)胞具有特異的毒性，使細(xì)胞代謝的氧化機(jī)制遭到破壞，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞壞死，使機(jī)體內(nèi)胰島素分泌不足，產(chǎn)生了高血糖，進(jìn)而引發(fā)了脂代謝和蛋白質(zhì)代謝的紊亂[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用STZ特異性破壞小鼠胰島β細(xì)胞，使血糖升高，造成血脂代謝紊亂其主要特點(diǎn)是TG升高HDL-C降低進(jìn)而建立糖尿病小鼠模型，其結(jié)果表明，與模型組相比，二甲雙胍組及BACR給藥組降低了FBG、TC、TG、LDL-C水平，提高了HDL-C水平，有效的調(diào)節(jié)了糖尿病小鼠體內(nèi)的血脂代謝。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激反應(yīng)在糖尿病的發(fā)展起著重要作用，在高糖情況下，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的自由基導(dǎo)致機(jī)體損傷進(jìn)而引發(fā)糖尿病的并發(fā)癥[9]。肝臟機(jī)體代謝調(diào)節(jié)的過(guò)程中扮演重要角色，同時(shí)也參與了氧化應(yīng)激體系的調(diào)節(jié)，STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝臟抗氧化能力下降明顯，會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)(SOD、MDA、GSH-Px)[10]。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的的中間產(chǎn)物之一，是氧化應(yīng)激損傷的重要標(biāo)記物，在STZ刺激下機(jī)體MDA的積累逐漸增多，進(jìn)一步損壞了細(xì)胞生物膜[11]。SOD和 GSH-Px是機(jī)體的清除劑，它們能特異性清除過(guò)氧自由基，羥基自由基，超氧陰離子[12]。作為脂質(zhì)過(guò)氧化的防御系統(tǒng)，減輕了活性氧的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予BACR治療后，糖尿病小鼠肝臟的MDA含量明顯下降，SOD和 GSH-Px含量明顯升高，提示BACR能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力有效減輕氧化應(yīng)激損傷。

TLR4是Toll樣家族的主要成員，其主要通過(guò)TLR4依賴(lài)的MyD88通路介導(dǎo)炎癥，當(dāng)機(jī)體中的炎癥因子過(guò)度釋放時(shí)，導(dǎo)致TLR4受體活化[13-14]。MyD88是TLR4信號(hào)通路的主要接頭蛋白，也是NF-κB信號(hào)通路中樞轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。MCP-1趨化因子主要來(lái)源于單核巨噬細(xì)胞，慢性炎癥中有重要作用。IL-1β是最活躍的炎癥因子之一，通常被當(dāng)作是炎癥反應(yīng)的生物標(biāo)記物。STZ誘導(dǎo)產(chǎn)生的高血糖使機(jī)體MCP-1、IL-1β過(guò)度釋放，加快了炎癥反應(yīng)進(jìn)程[15]，NF-κB作為T(mén)LR4下游傳導(dǎo)信號(hào)調(diào)控了MCP-1、IL-1β的轉(zhuǎn)錄，抑制了TLR4/MyD88/NF-κB通路的表達(dá)可以抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，二甲雙胍組和BACR給藥組降低了MCP-1、IL-1β的水平，下調(diào)了TLR4、 MyD88、NF-κB的蛋白表達(dá)，提示BACR對(duì)糖尿病的治療作用可能與其參與抑制炎癥因子有關(guān)。

綜上所述，BACR能夠改善糖尿病小鼠的血糖和血脂水平，其機(jī)制可能與改善氧化應(yīng)激能力，減輕炎癥反應(yīng)及抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

(致謝：實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室完成，感謝老師和同學(xué)的協(xié)助)