補陽還五湯類方對氧化應激PC12模型細胞CDK5及凋亡因子的影響

劉 芳，陳乃宏,3，胡耀梅，胥詠薇，朱炎貞

(1. 湖南中醫藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；2. 湖南省中藥飲片標準化及功能工程技術研究中心，湖南 長沙 410208；3. 中國醫學科學院藥物研究所，北京協和醫學院藥物研究所，北京 100050；4. 湖南中醫藥大學中西結合學院，湖南 長沙 410208)

腦缺血損傷的原發性和繼發性分子機制十分復雜，凋亡作為缺血性神經元死亡的一種主要途徑，其調控網絡也日漸清晰。細胞周期素依賴性蛋白激酶5(cyclin-dependent kinase 5，CDK5)是一種主要在神經元內表達的脯氨酸限定的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在調控神經元分化、皮質的形成、神經元細胞的遷移和神經軸突的生長過程中，起著至關重要的作用，具有潛在的調控神經元凋亡功能[4-6]。近年研究表明[7]，大鼠腦缺血后，神經細胞的損傷與CDK5的上調關系密切。故本課題組前期以大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型為研究對象，考察了補陽還五湯類方對模型大鼠海馬組織CDK5的調控作用[8]。本實驗擬以細胞模型，進一步驗證補陽還五湯類方對CDK5及其凋亡因子的調控。氧化應激是腦缺血進程中重要的病理生理反應，它是指體內氧化與抗氧化作用失衡，自由基在體內大量產生，引起細胞毒性反應，從而導致組織損傷的過程。本實驗即以此為基礎，觀察補陽還五湯類方對腦缺血體外氧化應激細胞模型的影響，從CDK5信號轉導途徑對腦缺血損傷后神經元凋亡機制展開研究。

1 材料

1.1 藥物補陽還五湯處方由黃芪120 g、當歸6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、紅花3 g、桃仁3 g、地龍3 g組成。補陽還五湯類方由黃芪、川芎、地龍按10 ∶3 ∶2的比例配伍組成，參照前期研究[2]，先將兩方藥物提取制備成干浸膏。使用前，采用無菌水配制成10 g·L-1的母液，經0.25 μm濾膜過濾除菌，使用時用無菌PBS稀釋至合適濃度。根據前期研究結果[3]，本實驗以1.0 g·L-1的補陽還五湯及其類方對細胞預處理2 h后，考察藥物對氧化應激模型細胞中相關蛋白的影響。

1.2 細胞大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系(PC12細胞)，高分化，購自長沙贏潤生物技術有限公司。PC12細胞是從大鼠腎上腺髓質瘤中分離得到的一種交感樣前體細胞株，它與神經細胞在發生學上均來源于神經嵴，在形態結構、生理生化功能上有類似神經元的表達和突觸，為國內外研究腦缺血所致的神經元損傷的理想替代模型[9]。將PC12細胞培養于培養瓶中，采用DEME高糖培養基培養，培養基含10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素。37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中溫育，待細胞貼壁融合至90%時，用0.25%的胰蛋白酶消化，加入培養基充分吹打至單細胞懸液，傳代或接種至合適的培養板中，繼續溫育48 h用于實驗。

1.3 試劑DEME高糖培養基(HyClone)；D-Hanks(Solarbio)；胎牛血清(Gibco)；MTT(美國Sigma公司)；二甲基亞砜(DMSO，BIOSHARP)；神經生長因子(nerve growth factor, NGF)(華美生物YP015779RA)；大鼠谷胱甘肽(glutathione, GSH) ELISA試劑盒(華美生物，E12144r)；大鼠L-乳酸脫氫酶(L-lactate dehydrogenase, L-LDH) ELISA試劑盒(華美生物，E11324r)；活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)檢測試劑盒(普利萊，C1300)；抗體CDK5(ab115812)、Tau(ab64193)、Bax(ab77566)、Bcl-2(ab32124)，均購自Abcam公司；羊抗鼠IgG-Dylight549(GAR002)、羊抗兔IgG-FITC(GAR001)，均購自聯科生物；超純RNA提取試劑盒(康為世紀，CW0597，含DnaseI)；逆轉錄第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas，K1622)；其他試劑均為分析純。

1.4 儀器Galaxy 170R CO2培養箱(德國Eppendorf公司)；Primo Vert倒置顯微鏡、Axio Scope.A1熒光正置顯微圖像分析系統(ZEISS)；Varioskan Flash多功能酶標儀(Thermo Scientific)；FACSVantage SE(Diva)流式細胞儀(BD)；7300 Real-time PCR檢測儀(美國ABI公司)。

2 方法

2.1 PC12氧化應激細胞模型的建立

2.1.1NGF誘導PC12向神經細胞分化 將PC12細胞接種于96孔板中，待細胞生長至對數生長期，分別用含NGF終濃度為1、2.5、5、7.5、10 μg·L-1的培養液繼續培養，并于12、24、48 h用顯微鏡觀察細胞分化情況。

2.1.2H2O2致PC12細胞損傷模型的建立 由于H2O2的不穩定性，為保證造模的成功，先根據前期研究[7]，確定H2O2致損模型所需的濃度范圍和時間，再將PC12細胞以1×104的密度接種于96孔板中。NGF誘導分化后，分別用含H2O2終濃度為0.1、0.3、0.5、0.75、1.0 mmol·L-1的培養液繼續培養，在損傷后2 h顯微鏡下實時觀察PC12細胞形態，以確定最佳損傷濃度。

水利工程建設項目評價是政府在招標過程中的主要參考因素。通常情況下，項目在競標之間，是要進行一些列咨詢和科學合理的評價等準備工作的，以便為工程的據測工作作不時之需。可是中小型水利工程項目顯然是沒有這樣充分的準備工作，也缺乏高效有力的評估組織團隊，施工的質量也就難以保證了。盡管我國現在已經出臺了很多相關方面的規章制度，但幾乎沒有基層水利工程是嚴格遵照這樣的標準和要求去執行的。

2.2 ELISA法檢測L-LDH和GSH的含量將生長好的PC12細胞以1×104/孔接種于96孔板中，待細胞生長至對數生長期，替換為無血清培養基，將細胞分成正常對照組、模型組(僅H2O2處理)、補陽還五湯組和補陽還五湯類方組，每組設6個復孔。待細胞與藥物作用2 h后，再加入0.3 mmol·L-1H2O2繼續置于細胞培養箱孵育2 h，收集各組細胞上清液，用L-LDH試劑盒檢測其含量。細胞經胰蛋白酶消化后，用100 μL PBS收集，冰上超聲裂解后，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，用GSH試劑盒檢測其含量。

2.3 流式細胞術檢測ROS的含量將生長好的PC12細胞以1×106/孔接種于6孔板中，待細胞生長至對數生長期，替換為無血清培養基，將細胞分成空白組(正常細胞不做任何處理)、正常對照組(正常細胞加入DCFH-DA探針)、H2O2模型組、補陽還五湯組和補陽還五湯類方組。當藥物與細胞作用2 h后，加入0.3 mmol·L-1H2O2處理2 h，棄去培養基，用預溫的PBS輕輕漂洗3次，加入終濃度為5 μmol·L-1的DCFH-DA熒光探針，避光，于37 ℃孵育30 min，取出用預溫的PBS漂洗、胰蛋白酶消化細胞后，收集細胞懸浮液，PBS洗滌后制備細胞單懸液，上流式細胞儀檢測ROS的含量。

2.4 免疫熒光法檢測CDK5、Tau蛋白在PC12細胞胞內的表達以Dylight549紅色熒光標記CDK5、FITC綠色熒光標記Tau，對胞內抗原定位，并根據熒光量進行半定量分析。將經多聚賴氨酸包被的玻片消毒后，置于6孔板中，將生長好的PC12細胞以1×105/孔接種于6孔板中，分為無一抗對照(H2O2處理→雙二抗)、陰性對照組(正常細胞不做任何處理)、正常對照組(正常細胞加雙一抗→雙二抗)、模型組(H2O2處理→雙一抗→雙二抗)、補陽還五湯和補陽還五湯類方干預組(藥物處理→H2O2處理→雙一抗→雙二抗)。待細胞爬片融合至80%，分別用藥物處理2 h后再用0.3 mmol·L-1的H2O2處理2 h，將6孔板從細胞培養箱中取出，按以下步驟處理：① 用預溫的PBS輕輕漂洗3次，每次5 min；② 4%的多聚甲醛室溫固定20～30 min，PBS漂洗后，用0.25% TritonX-100透化10 min；③ 5% BSA封閉30 min后，加入稀釋后的CDK5/Tau雙一抗混合液或Bcl-2/Bax雙一抗混合液，濕盒內4 ℃反應過夜；④ PBS漂洗后，再加入Dylight549和FITC標記的二抗混合液，室溫避光孵育1 h；⑤PBS漂洗后封片，熒光顯微鏡觀察，分別選擇綠色熒光通道和紅色熒光通道。

2.5 qPCR檢測PC12細胞內凋亡因子caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA水平將生長好的PC12細胞接種于細胞培養皿中，待細胞生長至對數生長期，替換為無血清培養基同步化12 h，將細胞分成正常對照組、模型組(H2O2處理)、補陽還五湯和補陽還五湯類方干預組。當藥物與細胞作用2 h后，加入0.3 mmol·L-1H2O2處理2 h，棄去培養基，收集細胞，采用RNA提取試劑盒提取組織RNA，按反應程序42 ℃，60 min；70 ℃，5 min；4 ℃，5 min逆轉錄合成cDNA，用特定引物(引物序列見Tab 1)對各目的基因反轉錄后進行PCR擴增，反應程序為：95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；40個循環。結果采用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量[10]。

Tab 1 Sequence of primers in qPCR

3 結果

3.1 H2O2致PC12細胞損傷建立氧化應激細胞模型采用NGF誘導PC12向神經元分化。Fig 1結果顯示，各濃度的NGF均可誘導PC12細胞向神經元分化，5 μg·L-1的NGF在24 h即可誘導PC12細胞分化，并隨著作用時間的延長分化越為明顯，突觸伸長至胞體的2～3倍，說明PC12細胞誘導后可獲得類似神經元的表達和突觸，能夠作為研究神經元分化及功能的替代模型。本實驗以5 μg·L-1的NGF與PC12細胞作用24 h，誘導其分化。

將不同濃度的H2O2與PC12細胞共同培育2 h后，如Fig 2所示，0.1 mmol·L-1的H2O2對細胞損傷非常小，僅有少量細胞變圓，隨著濃度的升高，細胞發生聚集、脫落，呈彌漫狀，當損傷濃度升高至1.0 mmol·L-1，鏡下視野幾乎無細胞存活，推測H2O2致PC12細胞損傷存在濃度依賴性。本實驗以0.3 mmol·L-1的H2O2與PC12細胞共同作用2 h制備氧化應激細胞模型。

3.2 補陽還五湯類方對氧化應激模型細胞L-LDH的抑制作用和GSH的保護作用由Tab 2可見，模型組細胞培養上清液中L-LDH的含量明顯高于正常對照組(P<0.01)；補陽還五湯類方與補陽還五湯作用細胞2 h后，均能明顯降低L-LDH活力(P<0.05)，抑制H2O2對PC12的損傷作用。正常PC12細胞中，GSH含量較高，與模型細胞中GSH的含量呈現明顯差異(P<0.01)；補陽還五湯類方與補陽還五湯均能一定程度對抗H2O2的過氧化損傷(P<0.01)，使胞內GSH保持在正常水平，對PC12細胞發揮保護作用。

Fig 1 Differentiation of PC12 to nervous induced by NGF for different time at concentration of 5 μg·L-1(×400)

A: 12 h; B: 24 h; C: 48 h.

Fig 2 PC12 cell morphology after treated with H2O2 for 2 h at different concentrations(×100)

A: Control; B: 0.1 mmol·L-1H2O2;C:0.3 mmol·L-1H2O2; D: 0.5 mmol·L-1H2O2;E:0.75 mmol·L-1H2O2; F:10 mmol·L-1H2O2.

Tab 2 Content of extracellular L-LDH and intracellular GSH examined by

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.3 補陽還五湯類方對氧化應激模型細胞中ROS的抑制作用如Fig 3所示，正常對照組中僅有5.81%的細胞被胞內的ROS氧化成有熒光的DCF，經H2O2處理后的模型細胞，具有綠色熒光陽性信號的細胞占42.7%，提示胞內ROS含量明顯增高，H2O2誘導的氧化應激模型可模擬腦缺血損傷過程，使氧化系統失衡，從而導致細胞損傷和死亡。補陽還五湯及其類方干預組中，具有陽性信號的細胞比例較模型組相比明顯降低，分別為12.4%和11.2%，提示兩方能一定程度抑制胞內ROS的異常升高。

3.4 補陽還五湯類方對氧化應激模型細胞中CDK5、Tau蛋白表達的影響如Fig 4所示，正常對照組細胞經CDK5和Tau雙一抗、雙二抗處理后，細胞質內可見少量較弱的熒光顆粒，提示正常的PC12內僅有少量CDK5、Tau蛋白的表達；當PC12細胞經H2O2處理后，模型組的胞質中可見大量較強的熒光顆粒，且在細胞間的胞絲(突觸)中亦可見熒光顆粒，提示H2O2誘導的氧化應激模型細胞質中表達了大量的CDK5、Tau；補陽還五湯類方和補陽還五湯干預組的細胞中熒光強度均出現一定程度的下降(P<0.05)，說明CDK5、Tau的表達量較模型細胞降低，提示補陽還五湯類方能對抗H2O2的過氧化作用，對PC12發揮保護作用。

Fig3ContentofintracellularROSinvariousgroupsexaminedbyFCMA: Blank control;B: Normal control; C: Model group; D: Buyang Huanwu decoction group; E: The recipe of Buyang Huanwu decoction group.

3.5 補陽還五湯類方對氧化應激模型細胞caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA的影響如Fig 5所示，caspase-3 mRNA、Bax/Bcl-2 mRNA的比值在氧化應激模型細胞中的表達較正常組明顯增加(P<0.01)；補陽還五湯及其類方與模型組比較亦有統計學差異(P<0.05)。結果表明，補陽還五湯及其類方均能一定程度降低caspase-3 mRNA和Bax/Bcl-2 mRNA的比值，從而抑制凋亡的發生。

Fig 5 Caspaes-3, Bax/Bcl-2 mRNA

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

4 討論

本實驗研究表明：以0.3 mmol·L-1H2O2處理細胞2 h成功復制腦缺血體外氧化應激細胞模型；1.0 g·L-1的補陽還五湯及其類方對氧化應激模型細胞具有保護作用，兩方均能明顯降低L-LDH的滲漏，增加胞內GSH的水平，抑制胞內ROS的異常增多。氧化應激過程中，L-LDH的含量可以反映細胞的損傷程度，正常細胞L-LDH的滲透率低，當細胞受損時，L-LDH釋放至細胞培養上清液中，上清液中含量越多，說明細胞損傷或死亡程度越大。GSH是生物體內最重要的非蛋白巰基化合物，參與保護細胞免受毒物的損害，是一個良好的表示氧化脅迫的指標，其含量可以直接反映該細胞的生理活性。ROS是指由分子氧直接或間接轉化而來、具有比分子氧更活潑的化學反應性的一類含氧物。正常情況下，可將ROS維持在一個穩定的范圍內，當平衡打破，ROS持續升高，將導致細胞損傷死亡。DCFH-DA是一種能自由通過細胞膜但不發光的化合物，在細胞內經脂酶水解生成DCFH，再經過ROS氧化生成有熒光的DCF，熒光強度與ROS含量呈正相關。

研究發現，CDK5及其下游蛋白Tau與神經元的分化、凋亡等多種生理及病理功能密切相關。當CDK5過量表達，將激活下游Tau蛋白在Ser199/202、Ser396/404位點過度磷酸化，引起腦組織中典型的神經纖維結纏，導致細胞凋亡。早在1997年，Green等[11]曾在大鼠全腦缺血模型中證明，腦缺血5 min時，海馬CA1區出現組蛋白H1激酶活性的增加，15 min后CDK5的磷酸化活性增加。Weishaupt等[12]發現，小鼠短暫性腦缺血損傷后，CDK5活性和p25表達增加與海馬CA1區的神經細胞凋亡有關。CDK5可以在細胞凋亡信號傳導途徑的上游進行調控，Rashidian等[13]通過免疫組化、水迷宮等方法，證明了局限性腦缺血模型和缺氧處理的神經細胞發生凋亡時,CDK5起著關鍵性的作用。本實驗研究表明，在氧化應激模型細胞中，CDK5信號通路被激活，CDK5及其下游蛋白Tau異常活化，凋亡相關蛋白caspase-3、Bax/Bcl-2表達水平上調，證實CDK5信號通路對腦缺血后神經細胞凋亡調控的重要性。補陽還五湯類方能有效抑制CDK5、Tau的表達水平，從而下調caspase-3、Bax/Bcl-2，且其效果與補陽還五湯原方差異無統計學意義，證實補陽還五湯類方可能通過CDK5信號轉導途徑下調凋亡因子，有效防止細胞凋亡，對氧化應激模型細胞發揮保護作用。從分子層面進一步證實了補陽還五湯類方的合理性和有效性。

補陽還五湯類方以黃芪30 g、川芎9 g、地龍3 g的比例入藥，重用原方中君藥黃芪，黃芪既治氣虛之本，又治血瘀之標，既大補元氣，又利營衛之氣，通營衛之阻滯以活血；川芎能升能散，其性走竄，補而不滯，走而不守，能上行頭目，旁達四肢，下行血海，血行則瘀去脈通也，使氣血和順，正所謂“血行風自滅”；地龍長于行散走竄，通經活絡，為佐藥。各藥合用，使氣足以推動血行，瘀去絡通，藥專力宏。為了更好發揮中藥復方的整體功效，減少傳統湯劑在煎煮過程中一些有效成分的丟失，補陽還五湯類方采用現代中藥制備工藝，將超臨界二氧化碳萃取法和醇提、水煎工藝相結合，保證中藥有效成分最大限度的溶出。

(致謝：本實驗完成于湖南省中藥飲片標準化及功能工程技術研究中心，得到該研究中心全體老師的指導及同學的協助，在此表示感謝。)