基于L-NAME誘導的高血壓小鼠血清代謝組學研究

杜夢繁，張光遠，王志瑋，周婷婷，馬 鑫

(江南大學1. 藥學院、2. 國家功能食品工程技術研究中心、3. 無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122)

高血壓是心腦血管的主要危險因素，是導致我國居民死亡的主要原因之一[1-2]。高血壓的發(fā)生和發(fā)展受遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響[3]，而在近年來的研究中，造成高血壓的主要因素60%與代謝異常有關,約80%的高血壓患者存在各種形式的代謝紊亂[4]。

代謝組學使用定量分析和生物信息學方法，檢測生物樣本中的代謝物組成和含量變化，推斷與疾病的發(fā)展和治療相關的特征性代謝產物[5]。其靈敏度高，可以檢測疾病早期小分子代謝物的變化[6]。本研究通過N-硝基-L-精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine methylester，L-NAME)誘導高血壓模型小鼠，使用超高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜(UPLC-QTOF/MS)對高血壓模型小鼠與對照小鼠的血清標本進行檢測，尋找高血壓病變的差異代謝產物。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 野生型C57BL6/J小鼠，♂，平均體質量約23 g，南京大學模式動物研究所提供，許可證編號：SYXK(蘇)2016-0012。

1.1.2試劑與儀器 L-NAME(美國Sigma公司)。小鼠無創(chuàng)血壓儀(美國IITC)；液相色譜2777C UPLC system、質譜Xevo G2-XS QTOF(Waters公司)。

1.2 方法

1.2.1L-NAME高血壓模型小鼠的構建 飲用添加L-NAME含量為0.5 g·L-1的無菌水，誘導小鼠血壓升高，對照組飲用正常無菌水。每天監(jiān)測小鼠血壓變化，連續(xù)監(jiān)測4周。

1.2.2樣本采集 小鼠眼眶取血，室溫靜置2 h，4 ℃、1 500×g離心20 min，取上清。

1.2.3樣本預處理 40 μL樣品的EP管中加入甲醇120 μL，封口后震蕩1 min，室溫靜置10 min，置于-20 ℃過夜；次日4 000×g、4 ℃離心30 min，取上清。

1.2.4UPLC-QTOF/MS分析條件 采用超高效液相色譜進行色譜分離，色譜柱柱溫為50 ℃，流速為0.4 mL·min-1，其中A流動相為水和0.1%甲酸，B流動相為甲醇和0.1%甲酸。對代謝物進行梯度洗脫。每個樣本的上樣體積為10 μL。

對從色譜柱上洗脫下來的小分子，利用高分辨串聯(lián)質譜Xevo G2-XS QTOF分別進行正負離子模式采集。采用MSE模式進行centroid數(shù)據采集，一級掃描范圍為50～1 200 u，掃描時間為0.2 s，對所有母離子按照20～40 eV的能量進行碎裂，采集所有的碎片信息，掃描時間為0.2 s。

2 結果

2.1 動物模型構建與血壓變化尾套法測小鼠血壓，高血壓模型構建成功，L-NAME組的血壓較對照組血壓有明顯的升高(P<0.01)。見Tab 1。

Tab 1 Effect of L-NAME diet on blood

**P<0.01vscontrol

2.2 主成分分析分析顯示，L-NAME組與對照組正離子模式和負離子模式下均存在差異，說明高血壓組的血清中組分發(fā)生了改變。

Tab 2 Serum metabolism biomarkers in hypertensive model mice and healthy control mice

aTrends of L-NAME group with control group of metabolites.(↑):up-regulated;(↓): down-regulated.

2.3 偏最小二乘判別分析L-NAME組與對照組分析結果顯示，正離子模式下，R2=0.9807，Q2=0.6623；負離子模式下，R2=0.971 1，Q2=0.822 5。分析結果顯示，該PLSDA模型的解釋能力和預測能力較好。

2.4 差異性代謝物篩選篩選差異表達的代謝物滿足條件：多變量分析PLS-DA模型前兩個主成分的VIP值≥ 1；單變量分析fold change≥1.2或者≤0.833 3；q-value<0.05。得到同時滿足3個條件的離子即差異離子。篩選出差異相對明顯的10個化合物，見Tab 2。

3 討論

L-NAME是NO合酶抑制劑，可以抑制內源性NO的產生[7]，造成內皮功能障礙，長期給予L-NAME可導致小鼠高血壓。高血壓小鼠血清代謝物成分發(fā)生改變，與正常小鼠相比，在正負離子模式下分別得到107和272個差異代謝物。發(fā)現(xiàn)十九烷酸等10種差異相對明顯的代謝物，可能成為高血壓發(fā)生的潛在生物標志物。值得注意的是，在KEGG數(shù)據庫中搜索了10種代謝物的可能匹配途徑，其主要涉及組氨酸代謝、丁酸代謝、碳代謝、TRP通道的炎癥介質調節(jié)和蛋白質的消化吸收等。我們將進一步深入研究對應化合物造成高血壓的具體機制，為高血壓的預防、診斷與治療提供初步參考數(shù)據。