基于高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜技術的復方菝葜體外物質基礎研究

何丹 黃小龍 陳林 梁雪娟 朱立華 張水寒

摘要：目的 ?采用高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（HPLC-Q-TOF-MS）技術分析復方菝葜化學成分。方法 ?色譜柱為Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長280 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量5 μL，流動相為甲醇-0.1%甲酸水，梯度洗脫;采用電噴霧離子源在負離子模式下采集數據，通過質譜信息、文獻檢索及中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）對各成分進行解析，并進行初步藥材歸屬。結果 ?從復方菝葜提取物中共解析出29個成分，主要包括酚酸類、黃酮類、脂肪酸類、三萜類、香豆素類等成分，部分化合物獲得初步藥材歸屬。結論 ?采用HPLC-Q-TOF-MS技術能準確、高效鑒定復方菝葜各組成成分，為其藥效學研究及質量控制提供依據。

關鍵詞：復方菝葜;高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜;酚酸;黃酮

中圖分類號：R284.1 ???文獻標識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）11-0068-06

Abstract： Objective To analyze the chemical compositions of compound Smilacis Chinae Rhizoma through high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry （HPLC-Q-TOF-MS）. Methods HPLC used ultimate AQ-C18 column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm）; detection wavelength was 280 nm; gradient elution with methanol-water （containing 0.1% formic acid） as mobile phase and flow rate of 0.6 mL/min; column temperature was 25 ℃; the injection volume was 5 μL. Data was acquired in negative ion mode using ESI. Each composition was analyzed by mass spectrometry information， literature search， and TCM System Pharmacology Database and Analysis Platform （TCMSP）. Preliminary attribution of Chinese materia medica was conducted. Results A total of 29 compositions were analyzed from the compound Smilacis Chinae Rhizoma， including phenolic acids， flavonoids， fatty acids， triterpenoids， coumarins， etc.， and each composition has preliminary attribution of Chinese materia medica. Conclusion HPLC-Q-TOF-MS technology can be used to identify the compositions of compound Smilacis Chinae Rhizoma， which provides references for its pharmacodynamic study and quality control.

Keywords： compound Smilacis Chinae Rhizoma; high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry; phenolic acids; flavonoids

復方菝葜顆粒（國藥準字B20020355）由菝葜、魚腥草、貓爪草、款冬花、枸杞子、大棗（去核）、土鱉蟲、鮮鱧魚組成，具有清熱解毒、軟堅散結、滋陰益氣功效，可用于改善肺癌、子宮頸癌伴有咳嗽、胸痛、帶下異常等癥狀，是治療肺癌的復方制劑。復方菝葜顆粒配合放療、化療或手術等治療癌癥，可緩解患者痛苦，起到增效減毒的作用;對于晚期失去手術機會的患者，可明顯改善臨床癥狀，提高患者生存質量，延長生存期[1]。

高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（HPLC-Q-TOF-MS）技術作為一種體外物質基礎研究手段，具有分辨率高、效率高、靈敏度高、準確性強等優勢，較傳統分離分析技術可明顯縮短分析周期，尤其適用于復雜組分的成分分析，全面闡明中藥組成，有利于整體把握復方物質基礎，目前已廣泛應用于中藥及復方制劑成分分析[2-3]。中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/ LSP/tcmsphp）以《中華人民共和國藥典》為核心，整合了499種中草藥，收納29 000余種化學成分，可用于中藥及復雜成分的發現與開發[4]。

本研究利用HPLC-Q-TOF-MS技術對復方菝葜的化學成分進行檢測分析，聯合文獻調研和TCMSP對各成分進行初步歸屬和類別歸納，為復方菝葜顆粒的藥效學研究和質量控制提供依據。

1 ?儀器與試藥

安捷倫1290 Infinity型高效液相色譜系統（配有四元泵及在線脫氣、紫外檢測器、6530 Q-TOF質譜儀），安捷倫科技公司;AL204型十萬分之一電子分析天平，梅特勒-托利多公司;KM-500DB型超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司。

試驗樣品均購自湖南永康堂大藥房連鎖有限公司，經湖南省中醫藥研究院中藥研究所劉浩助理研究員鑒定，菝葜（批號2017110101）為百合科植物菝葜Smilax china L.的干燥根莖，魚腥草（批號18110501）為二白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鮮全草或干燥地上部分，貓爪草（批號18053002）為毛茛科植物小毛茛Ranunculus ternatus Thunb.的干燥塊根，枸杞子（批號18120902）為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarm L.的干燥成熟果實，大棗（批號20180101）為鼠李科植物棗Ziziphus jujuba Mill.的干燥成熟果實，款冬花（批號180901）為菊科植物款冬Tussilago farfara L.的干燥花蕾，土鱉蟲（批號20161006）為鱉蠊科昆蟲地鱉Eupolyphaga sinensis Walker或冀地鱉Steleophaga plancyi（Boleny）的雌蟲干燥體。

落新婦苷對照品（批號1DBG-QHTR，HPLC純度≥98%），中國食品藥品檢定研究院;金絲桃苷對照品（批號CHB160904，HPLC純度≥98%）、3，5-二咖啡酰奎寧酸對照品（批號CHB171013，HPLC純度≥98%）、3，4-二咖啡酰奎寧酸對照品（批號CHB160725，HPLC純度≥98%）、4，5-二咖啡酰奎寧酸對照品（批號CHB160726，HPLC純度≥98%），成都克洛瑪生物科技有限公司。甲酸和甲醇均為色譜純，美國TEDIA公司;其余試劑均為分析純;水為純凈水，華潤怡寶飲料（長沙）有限公司。

2 ?方法

2.1 ?樣品制備

精密稱取菝葜、魚腥草、貓爪草、枸杞子、大棗（去核）各150 g，款冬花、土鱉蟲各50 g，鮮鱧魚90 g。第1次加3760 mL水，煎煮1.5 h，第2次加2820 mL水，煎煮1 h，合并煎液，濃縮，冷凍干燥儀干燥，得浸膏，備用。取5 g復方菝葜浸膏，溶于20 mL水分散，石油醚（每次40 mL）萃取至下層無色，下層繼續用乙酸乙酯（每次40 mL）萃取4～5次，合并上層溶液，濃縮，蒸干，用甲醇復溶至10 mL。

2.2 ?色譜條件

色譜柱為Ultimate AQ-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長280 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量5 μL，流動相為甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～20%A;10～17 min，20%～25%A;17～19 min，25%～25%A;19～21 min，25%～28%A;21～35 min，28%～30%A;35～42 min，30%～36%A;42～50 min，36%～39%A;50～70 min，39%～44%A;70～80 min，44%～95%A;80～90 min，95%～95%A）。

2.3 ?質譜條件

電噴霧離子源（ESI），負離子模式掃描，毛細管電壓4 000 V，離子源溫度350 ℃，霧化器壓力276 kPa，干燥器體積流量6 L/min，錐孔65 V，干燥器溫度350 ℃，碎片電壓135 V，質量數掃描范圍m/z 100～1000，采樣頻數0.1 s、間隔0.02 s，碰撞能量分別采用10、15 eV。測量樣品前使用調諧液校準質量軸，以降低質量精準度誤差。

3 ?結果

從復方菝葜提取物中共獲得29個化合物，分別為：6個脂肪酸類、11個酚酸類、7個黃酮類、2個三萜類、1個香豆素類。基峰圖見圖1。將保留時間（tR）、質譜信息結合對照品、相關文獻及TCMSP數據進行化學成分指認和初步藥材歸屬，結果見表1。

3.1 ?脂肪酸類

共鑒定6個已知的脂肪酸，負離子模式下產生[M-H]-的分子離子峰具體為：琥珀酸（峰1）m/z 117.018 5，壬二酸（峰18）m/z 187.096 8，棕櫚酸（峰28）m/z 255.232 8，亞油酸（峰24）m/z 20.217 3，亞麻酸（峰25）m/z 279.232 6，11-十八碳烯酸（峰29）m/z 281.248 1。前3個成分為飽和脂肪酸，后3個成分為不飽和脂肪酸。這些通常以羧基部分失去H2O和CO2形成的碎片離子為主，其中多不飽和脂肪酸及一些單不飽和脂肪酸的質譜特征還在于出現一系列以14 m/z為基本單位分開的離子峰，可通過切割脂肪酸鏈中的連續C-C單鍵定位不飽和脂肪酸雙鍵的位置。故峰24、25、29還分別出現了m/z 209[M-H-C5H10]-、m/z 249[M-H-C2H4]-、m/z 197[M-H-C6H12]-用作分子中存在雙鍵的指示劑，裂解途徑與文獻報道[5]一致。以11-十八碳烯酸為例，其碎片離子及結構見圖2。

圖2 ?11-十八碳烯酸二級碎片離子圖

3.2 ?酚酸類

峰3、4、5的tR分別為12.084、14.453、16.905 min，負離子模式下生成的[M-H]-準分子離子峰分別為m/z 167.033 8、m/z 153.018 6和m/z 137.023 5;均檢測到失去CO2的特征碎片離子[M-H-CO2]-，分別為m/z 123、m/z 109、m/z 93，根據元素組成分析，三者對應的分子式分別為C8H8O4、C7H6O4、C7H6O3，其相對分子質量分別為168、155和138，推測峰3、4、5可能分別為香草酸、原兒茶酸和對羥基苯甲酸，對羥基苯甲酸的碎片離子及結構見圖3。峰7在峰5基礎上還檢測到m/z 137[M-H-CH3]-的碎片離子，根據其元素組成分析，該化合物分子式為C8H803，推測該成分為對羥基苯甲酸甲酯。峰11、12的tR分別為20.692、34.039 min，峰11的質譜信息檢測到離子對m/z 179.034 6[M-H]-和m/z135[M-H-CO2]-，峰12號的質譜信息檢測到離子對m/z 163.039 3[M-H]-和m/z 119[M-H-CO2]-，根據二者元素組成為C9H8O4、C9H8O3，分別推測為咖啡酸和對香豆酸。以上質譜信息與文獻報道[6-7]一致。