GeneXpert MTB/RIF快速檢測在肺結核患者診斷中的應用價值

鐘 莉，許 鎧

(云南省紅河州第一人民醫院檢驗科，云南蒙自 661199)

我國是全球范圍內的22個肺結核高負擔國家之一，每年肺結核發病率居第3位[1]，肺結核患者的早診斷對預防肺結核傳播及提高治療效果有積極意義，傳統的細菌學診斷方法包括痰涂片顯微鏡檢查、結核分枝桿菌(MTB)固體培養。涂片抗酸染色顯微鏡檢查至少需要每毫升含10 000個抗酸菌的標本才能檢出，靈敏度低，并且不能區分MTB和非MTB；MTB固體培養方法耗時長，不能有效滿足早診斷、早治療的要求。2010年WHO推薦Xpert MTB/RIF系統用于結核病的快速診斷和MTB對利福平的耐藥性檢測[2]，這種檢測方法靈敏度高，可以準確、快速地檢測出利福平耐藥基因(ropB突變基因)，成為結核病檢查的重要方法之一。本研究對肺結核患者和疑似肺結核患者的標本采用了Xpert MTB/RIF快速檢測、抗酸染色、全血γ-干擾素釋放試驗、血清結核桿菌IgG檢測，旨在評價Xpert MTB/RIF快速檢測的應用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016年9月至2018年12月在本院就診并住院的肺結核和疑似肺結核患者共106例納入研究，上述人群均送檢了Xpert MTB/RIF、抗酸染色、全血γ-干擾素釋放試驗、血清結核桿菌IgG檢測4個檢測項目；男性77例，年齡14～79歲；女性29例，年齡17～83歲。106例患者的出院診斷顯示，31例為肺結核復治患者，這些患者均有肺結核病史，曾進行抗肺結核治療；7例患者為AIDS合并肺結核，其中2例有肺結核既往史，3例患者Xpert MTB/RIF檢測為MTB陽性且CT影像提示肺結核，2例患者CT提示為陳舊性肺結核經抗肺結核治療好后好轉；其余68例為肺結核及其他診斷的患者，CT均有疑似肺結核的影像，患者均有肺結核的臨床癥狀。

1.2儀器與試劑 主要的儀器包括GeneXpert檢測系統(美國賽沛公司)、酶標儀(安圖公司)、二級生物安全柜；主要的試劑包括MTB rpoB基因和突變檢測試劑盒采用賽沛公司配套試劑；結核感染T細胞檢測試劑盒購自北京萬泰生物藥業股份有限公司；結核桿菌IGg抗體試劑購自英科新創(廈門)科技有限公司產品；抗酸染色液(冷染法)購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3方法

1.3.1晨痰標本Xpert MTB/RIF快速檢測 把樣品消化液(消化液和痰液按2∶1的比例)加入盛有痰標本中痰杯內(要求患者晨痰標本合格，不少于2 mL，理想的標本量應為3～4 mL，用同一份標本做抗酸染色)，視痰標本的黏稠度調整處理液的加入量，蓋上痰杯蓋子，在振蕩器上振蕩15～30 s，室溫靜置10 min，再次振蕩15～30 s，室溫靜置5 min，樣品在測試之前應完全液化，無肉眼可見的痰塊。取2 mL處理好的樣品至反應盒中，然后將反應盒置于檢測模塊，儀器開始自動檢測，檢測耗時1 h 50 min，MTB檢測結果以高、中、低、極低和未檢出5個量級來表示，利福平耐藥基因結果以檢出和未檢出表示。

1.3.2抗酸染色 按照《痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[3]中的標準進行操作，結果以1+、2+、3+、4+和陰性表示。

1.3.3全血γ-干擾素釋放試驗 采集患者的空腹靜脈血，置于肝素鈉抗凝管中，嚴格按照MTB特異性細胞免疫反應試劑盒的說明書進行檢測，結果以陽性或陰性報告。

1.3.4結核桿菌IgG抗體檢測 采用結核桿菌IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)進行檢測，嚴格按照檢測試劑盒的說明書進行操作，結果以陽性或陰性報告。

1.4統計學處理 采用SPSS19.5進行統計分析，陽性檢出率的比較采用χ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.14種方法檢測患者痰標本 Xpert MTB/RIF高于抗酸染色、結核桿菌IgG抗體檢測的陽性率，差異均有統計學意義(χ2=41.86、34.92，P<0.05)，與γ-干擾素釋放試驗陽性率比較差異無統計學意義(χ2=1.024，P>0.05)，見表1。4種方法檢測都為陽性的患者有13例。

表1 4種檢測方法的陽性率(n=106)

注：與Xpert MTB/RIF比較，*P<0.05

2.2Xpert MTB/RIF檢測基因突變 106例患者晨痰標本檢出14例rpoB基因突變，耐藥率為19.18%(14/106)。8例探針位點為ProbeD，6例為ProbeE。

2.3Xpert MTB/RIF與抗酸染色結果的分析 Xpert MTB/RIF檢測為MTB高量級的8例患者抗酸染色均為陽性；MTB中量級的37例患者中，抗酸染色陽性15例；15例MTB低量級的患者中，抗酸染色陽性2例；13例MTB極低量級的患者中，抗酸染色陽性1例；33例未檢出MTB的患者抗酸染色均陰性。Xpert MTB/RIF與抗酸染色的檢測結果比較，差異有統計學意義(χ2=41.86，P<0.05)，見表2。

表2 Xpert MTB/RIF與抗酸染色比較

3 討 論

Xpert MTB/RIF是可同時進行MTB及利福平耐藥性檢測的自動化、全封閉檢驗平臺。近年來，該技術被用于臨床分離株、痰液標本及少數肺外結核標本MTB及利福平耐藥性的檢測，多項研究證實其具有靈敏度與特異度高，生物安全性好、耗時短等優點，成為WHO推薦的藥敏感性分子檢測技術[4-6]。

Xpert MTB/RIF快速檢測MTB的半定量結果分為高、中、低、極低、未檢出5個級別。本研究檢出的8例MTB高量級標本抗酸染色均為陽性，抗酸染色結果為2+～3+；檢出的37例MTB中量級標本中，抗酸染色陽性15例(占40.55%)，抗酸染色結果均為1+；低和極低量級標本，抗酸染色陽性檢出率很低，分別是2例和1例，抗酸染色結果均為1+，說明Xpert MTB/RIF檢測的量級結果與標本中MTB數量呈正相關，抗酸染色方法結果也可能與標本中MTB數量呈正相關，這與文獻報道一致[18]。樣本中MTB數量很低的時候抗酸染色(直接涂片法)很可能鏡檢找不到，MTB中量級標本如果標本處理不當或標本質量欠佳時抗酸染色(直接涂片法)鏡檢就可能漏檢。Xpert MTB/RIF 快速檢測在這些患者的臨床診治中有較高的靈敏度和特異度，與國內外研究結果也基本一致[7-9]。

中國是耐藥結核病高負擔國家之一，尤其是耐多藥結核病，是目前臨床工作中遇到的重大挑戰和主要障礙[10]，根據WHO報道，80%以上對利福平耐藥的結核病患者同時對異煙肼耐藥，即絕大多數對利福平耐藥的結核病患者為耐多藥結核病患者。Xpert MTB/RIF可檢測利福平耐藥基因，盡早發現結核感染與耐藥結核，可以為治療與治愈結核創造機會。Xpert MTB/RIF快速檢測技術還可以用于腦脊液、關節液、胃液、組織等肺外標本的檢測[11-12]。

Xpert MTB/RIF核酸檢測方法采用GeneXpert檢測系統，是一種半巢式實時熒光定量PCR體外診斷技術，以rpoB基因為靶基因，自動提取DNA后擴增rpoB基因的192 bp片段進行檢測，采用3種特異的引物和6種分子信標，同時檢測6種探針，其中5個相互重疊的分子探針(分別以探針A～E命名)選擇性覆蓋rpoB基因的81 bp核心區，用于檢測利福平耐藥。

Xpert MTB/RIF技術由于檢測費用高，推廣普及有一定困難，不能夠檢測非MTB，不能區分死菌和活菌[13]，另外Xpert Mtb/RIF只能檢測一種藥物耐藥基因，檢測結果受一些特殊的利福平耐藥相關基因突變的影響，例如耐多藥菌株由于含有rpoB1491F突變而不能被檢測出[14]。也有研究表明，rpoB533區的亮氨酸變為脯氨酸可導致假陰性的出現[15]。

γ-干擾素釋放試驗檢測需耗時20多小時，在肺結核和肺外結核患者中的檢出率較高，優于抗酸染色(直接涂片法)和結核桿菌IgG抗體檢測[16]，但不能檢測耐藥基因，不能將既往感染和活動性肺結核進行區分。結核桿菌IgG抗體檢測陽性，有可能是由注射過卡介苗的交叉反應導致。4種方法比較，Xpert MTB/RIF快速檢測的檢出率和指導治療的價值均較高，與趙冰等的研究結果相似[17-18]。

4 結 論

GeneXpert MTB/RIF快速檢測能提高菌含量少的痰液標本或肺結核患者抗酸染色(直接涂片法)陰性標本的MTB檢出率，能盡早發現耐藥結核菌，對肺結核的診斷和用藥指導優于其他3種方法。