長鏈非編碼RNA RP11-110G21.1在結腸癌中的表達及其機制研究

曹暉，張申，劉琦，顧越雷

結腸癌是胃腸道中常見惡性腫瘤，近年來隨飲食結構、生活習慣的變化，結腸癌發生率不斷增加。結腸癌的發生是多種癌基因、抑癌基因參與調控的疾病，其病理機制尚未完全闡明[1-3]。長鏈非編碼RNA(long chain non-coding RNA，lncRNA)是包含大于200個核苷酸但不具有蛋白編碼能力的RNA分子，在X染色體沉默、基因組印記、核內運輸等多種調控過程中發揮重要作用[4-6]。關于lncRNA在腫瘤發生發展及預后判斷中的作用研究日益增多。前期研究通過lncRNA芯片發現，lncRNA RP11-110G21.1在結腸癌組織標本中異常表達，然而有關結腸癌組織中lncRNA RP11-110G21.1表達的臨床意義未見研究。因此本研究通過觀察結腸癌組織及其癌旁組織lncRNA RP11-110G21.1表達差異，并分析其表達與臨床病理參數及預后的關系，以及檢測沉默lncRNA RP11-110G21.1后對結腸癌細胞株增殖、遷移、侵襲的影響，從而研究lncRNA RP11-110G21.1在結腸癌中的表達情況及其在結腸癌發生發展中的作用，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年8月—2015年12月上海市松江區中心醫院消化外科診治結腸癌患者120例臨床資料，所有病例均為初診，其中男71例，女49例，年齡41～72(56.32±5.16)歲。普查便隱血陽性而無癥狀者56例，解暗紅色血便伴消瘦28例，陣發性腹痛伴大便習慣改變19例，出現急性腸梗阻17例，均行腸鏡檢查明確診斷。合并癥：心臟病(心律失常、心肌缺血)46例，糖尿病39例(血糖控制良好)，輕度慢性阻塞性肺疾病13例；有明確家族史者9例。有癥狀者出現癥狀到腸鏡檢查2周～9個月，中位數16周。所有病例均經肺部CT平掃、腹部增強CT或增強MR檢查，排除遠處轉移。以手術過程中切除并凍存的結腸癌組織為結腸癌組，距癌組織邊緣≥2 cm的癌旁組織為癌旁組織組，術前患者均未進行手術、放化療及免疫治療。排除標準：合并其他部位惡性腫瘤；具有嚴重肺功能損傷、大面積心肌梗死、嚴重糖尿病患者。本研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意并簽署知情同意書。患者術后定期通過門診復查及電話隨訪形式隨訪，隨訪時間為3年。

1.2 觀測指標與方法

1.2.1 qRT-PCR法檢測結腸癌組織中lncRNA RP11-110G21.1表達： 應用TRI試劑提取結腸癌組織及其癌旁組織標本、人正常結腸上皮細胞(NCM460)、結腸癌細胞(LoVo)細胞株中的總RNA,應用Bio Rad逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，采用2×SYBR Green PCR MAsterMix，以cDNA為模板，進行qRT-PCR檢測，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，lncRNA RP11-110G21.1正向引物：5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，反向引物：5’-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3’；GAPDH正向引物：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。PCR反應條件：95℃ 10 min；95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環。采用2-△△Ct算法計算lncRNA RP11-110G21.1相對表達量。試驗重復3次，取平均值。

1.2.2 細胞株及細胞培養：NCM460及LoVo細胞(購自美國ATCC公司)置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，在37℃、飽和濕度、5%CO2條件下無菌恒溫培養箱內培養。根據細胞生長情況定期換液與傳代，3代后進行計數，進行細胞接種。

1.2.3 細胞轉染：取對數期LoVo細胞以4×105/孔接種到細胞培養板，培養至細胞融合達到80%左右，更換為不含胎牛血清的RPMI 1640培養基。采用Lipofectamin 2000試劑進行轉染，根據使用說明書，分別加入lncRNARP11-110G21.1NC(NC組)和lncRNARP11-110G21.1NC inhibitor(inhibitor組)，加入事先裝有Opti-Medium 100 μl的 RNAasefree離心管中，然后加入Lipofectamin 2000試劑4 μl，將質粒與對應脂質體溶液混合，靜置20 min，加入培養孔，另取裝有Opti-Medium 100 μl的 RNAasefree離心管作為空白組。轉染后48 h收集細胞，提取總RNA及總蛋白供后續使用。

1.2.4 CCK-8法檢測下調lncRNA RP11-110G21.1表達對細胞增殖的影響：取各組細胞，離心棄上清，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，吹打混勻，制成細胞懸液，取細胞懸液10 μl，加入含RPMI 1640 1 ml EP管內，吹打混勻，取稀釋細胞懸液10 μl，細胞計數板計數，以1.0×105個/ml細胞密度接種于12孔板，每孔100 μl，每組3個復孔。在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養24 h，每孔加入濃度為1.5 mg/ml CCK-8 10 μl，培養 4 h后每孔加入 DMSO 150 μl，分別于0 h、24 h、48 h、72 h、96 h讀取吸光度值(OD)，繪制細胞生長曲線，測定時以未接種細胞只加培養基孔的為空白對照調零。

1.2.5 Transwell小室法檢測下調lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞遷移、侵襲的影響：侵襲試驗，收集各組細胞，在上層小室平鋪稀釋為1 μg/μl的Matrigel膠100 μl，37 ℃孵育4 h，計數后于無血清的DMEM培養液中重懸。上室加入細胞懸液100 μl ，下室加入600 μl 含10 % 胎牛血清的RPMI 1640完全培養基。37℃培養24 h后取出小室，用棉簽擦除上層小室內的細胞和 Matrigel 膠，將細胞與1%多聚甲醛混合固定后用0.1 %結晶紫染色，用倒置顯微鏡[CG1-XDS-1B型，西化儀(北京)科技有限公司]隨機選取5個視野并拍照，進行統計分析。實驗重復3次，取平均值。遷移試驗除不加入Matrigel膠外，其余步驟與侵襲試驗完全相同。

2 結 果

2.1 2組lncRNA RP11-110G21.1表達比較 與癌旁組織lncRNA RP11-110G21.1表達水平(1.01±0.15)比較，結腸癌組織(1.73±0.24)顯著升高(t=27.868，P=0.000)。

2.2 下調結腸癌細胞lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞增殖的影響 與NCM460細胞比較，LoVo細胞株lncRNA RP11-110G21.1表達顯著升高(P<0.05)；與空白組、NC組比較，inhibitor組LoVo細胞lncRNA RP11-110G21.1顯著降低(P<0.05)。CCK-8檢測顯示，轉染lncRNA RP11-110G21.1 inhibitor后，LoVo細胞48 h后增殖較空白組與NC組顯著降低(P<0.05)，3組間比較，差異有統計學意義(F=320.875，P<0.01)，見圖1。

2.3 下調結腸癌細胞lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞遷移、侵襲的影響 與空白組比較，NC組遷移、侵襲細胞數差異無統計學意義(P>0.05)，inhibitor組遷移、侵襲細胞數顯著降低(P<0.05)；與NC組比較，inhibitor組遷移、侵襲細胞數顯著降低(P<0.05)，見圖2(封3)、表1。

表1 Transwell試驗檢測下調lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞遷移、侵襲能力的影響個/HP)

注：與空白組比較，aP<0.05，與NC組比較，bP<0.05

注：A.NCM460、LoVo細胞株lncRNA RP11-110G21.1表達；B.細胞轉染后LoVo細胞lncRNA RP11-110G21.1表達；C.下調lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞增殖的影響；與NCM460亞組比較，aP<0.05；與空白組比較，bP<0.05；與NC組比較，cP<0.05

圖1 各組lncRNA RP11-110G21.1表達比較及下調lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞增殖的影響

2.4 不同臨床病理特征患者中lncRNA RP11-110G21.1表達的變化 以lncRNA RP11-110G21.1表達水平的平均值1.73為界分為高表達亞組76例和低表達亞組44例，結果顯示lncRNA RP11-110G21.1在不同性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、腫瘤類型、淋巴結轉移比較差異無統計學意義(P>0.05)，而在分化程度低、TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者中的高表達比例高于分化程度中高、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期患者(P<0.05)，見表2。

2.5 結腸癌組織中lncRNA RP11-110G21.1表達與患者預后的關系 Kaplan-Meier結果顯示，lncRNA RP11-110G21.1高表達亞組3年內存活率(27.6%)低于低表達亞組(61.4%)(χ2= 13.212，P= 0.000)，見圖3。

圖3 結腸癌患者lncRNA RP11-110G21.1表達生存曲線分析

2.6 結腸癌患者預后危險因素分析 多因素Logistic回歸分析顯示，分化程度低、TNM分期高、lncRNA RP11-110G21.1高表達是影響結腸癌患者不良預后的危險因素(P<0.05)，見表3。

3 討 論

結腸癌是常見的發生于結腸部位的消化道惡性腫瘤，發病率占胃腸道腫瘤的第3位。結腸癌發病與高脂肪和低纖維飲食有關，近年來隨飲食結構的變化，結腸癌發病率呈上升趨勢。結腸癌早期癥狀不明顯，中期也僅有腹脹、消化不良等癥狀，待發生腹痛、黏液便時已為中晚期，且伴隨病灶轉移，貽誤最佳治療時期[7-12]，因此提高結腸癌早期診斷率、尋找新的分子治療靶標及轉移、復發預警指標成為結腸癌研究中需解決的重大問題。結腸癌發生是多基因參與的過程，目前已發現多種促癌、抑癌基因參與結腸癌的癌變進程[13-17]。lncRNA是近年來發現的一類調控型RNA，成為腫瘤生物學領域的研究熱點[18]。前期研究發現，lncRNA RP11-110G21.1在結腸癌組織標本中表達異常。而本研究結果顯示，結腸癌組織中lncRNA RP11-110G21.1表達顯著高于其癌旁組織，提示lncRNA RP11-110G21.1高表達與結腸癌的發生發展有關，且與分化程度、TNM分期及預后密切相關，此結果與上述研究結果基本一致，表明lncRNA RP11-110G21.1異常高表達在結腸癌的發生與轉移過程中發揮重要作用，同時也說明lncRNA RP11-110G21.1高表達縮短患者生存時間，不利于結腸癌患者預后，因此檢測lncRNA RP11-110G21.1水平可能對預測結腸癌的生物學行為與預后評估均具有一定參考價值。

表2 lncRNA RP11-110G21.1表達與結腸癌患者臨床參數的關系 [例(%)]

表3 結腸癌患者不良預后影響因素Logistic分析

本研究進一步通過在結腸癌細胞系LoVo中轉染lncRNA RP11-110G21.1 inhibitor使之表達下調，探討下調lncRNA RP11-110G21.1表達對LoVo細胞增殖影響，結果表明，轉染lncRNA RP11-110G21.1 inhibitor后24 h細胞增殖緩慢且3組間差異不顯著，可能由細胞毒性影響轉染導致，48 h后inhibitor組吸光度(OD)值顯著低于空白組及NC組，同時發現下調lncRNA RP11-110G21.1表達可使結腸癌細胞侵襲、遷移能力顯著降低。推測下調lncRNA RP11-110G21.1表達可抑制結腸癌癌細胞侵襲、轉移，進一步說明lncRNA RP11-110G21.1可能通過影響結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲能力影響結腸癌患者預后，但是由于本研究僅初步探討lncRNA RP11-110G21.1與結腸癌的關系，其內在具體機制還有待進一步深入分析。

綜上所述，lncRNA RP11-110G21.1在結腸癌患者組織高表達，與患者臨床分期等病理特征有關，檢測其表達水平可能為預測患者腫瘤進展情況與評估預后提供參考；且降低lncRNA RP11-110G21.1表達可抑制結腸癌增殖、侵襲、遷移能力，可為提高結腸癌的診療效果提供新的研究思路。本研究存在一定不足之處，關于lncRNA RP11-110G21.1在結腸癌中的具體作用機制有待進一步研究。