基底剛度對人宮頸癌HeLa 細胞增殖及順鉑藥物敏感性影響的體外研究△

焦思萌，趙軒宇，宋丹，陳嬌，商若天，張強，劉思迪，孔為民#，韓東

首都醫科大學附屬北京婦產醫院1產一科，2婦瘤科，北京 100006

3國家納米科學中心，北京100190

子宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在女性生殖系統惡性腫瘤中發病率位居首位[1]。中國每年新發病例約13.15萬例，每年死于宮頸癌的患者約5萬例[2]。在中晚期宮頸癌的治療中順鉑是單藥化療最有效的藥物[3]，但因患者的個體差異和化療耐藥的問題，宮頸癌患者化療療效存在很大差異。目前有關宮頸癌化療敏感性及化療耐藥的相關研究多集中于宮頸癌細胞內在因素的影響，如相關基因、蛋白的表達，相關信號轉導通路等。宮頸癌細胞并不是孤立生長的，其所生存的細胞微環境可能在其發生、發展的過程中發揮著重要作用[4]。腫瘤微環境中的參數包括剛度、形貌、曲率及剪應力等。基底剛度是腫瘤微環境中的一個重要的力學參數，剛度是指細胞或組織在載荷作用下抵抗彈性形變的能力。本研究從細胞微環境中的力學因素出發，探討改變基底剛度是否會影響宮頸癌細胞的生長情況，是否影響順鉑對宮頸癌細胞的細胞毒作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞來源及實驗試劑 人宮頸癌HeLa細胞株購自美國模式培養物集存庫；順鉑粉劑購自美國Sigma公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.1.2 不同基底剛度培養皿的選擇 水凝膠培養基模擬不同組織的剛度。選擇0.5、5、25kPa分別模擬淋巴結、肺組織及宮頸脫落細胞的剛度；并以普通塑料培養皿作為對照，其剛度約為106kPa[5]。可控剛度的水凝膠培養皿購自北京德潤豐科技有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HeLa 細胞的培養 將HeLa細胞培養于含有10%胎牛血清的DMEM完全培養液中，置于37℃、5%CO2條件下培養。取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞增殖活性檢測 取對數生長期的HeLa細胞，以每孔2×l04個細胞分別接種于基底剛度為0.5、5、25 kPa水凝膠培養皿及普通塑料24孔板（106kPa）中培養。分別于接種后第4～96小時，按照CCK-8試劑盒說明書操作，在450 nm波長處測定細胞活性。每個剛度每個時間點條件下設立5個平行孔，實驗共重復3次。

1.2.3 順鉑藥敏實驗 在不同基底剛度分組的基礎上，按照不同給藥濃度分為順鉑加藥組，同時設立陰性對照組（含細胞和培養基，不加藥物，即藥物濃度為0 μmol/L）及空白對照組（不含細胞只含培養基），每組設立3個復孔，實驗重復3次。順鉑藥物濃度梯度根據藥物血峰值濃度（peak plasma concentration，PPC）設計，順鉑藥物PPC為12.6 μmol/L[6]，故設順鉑藥物濃度梯度為0、5、10、20、40 μmol/L。取對數生長期的HeLa細胞，以每孔2×l04個細胞的密度分別接種于基底剛度為0.5、5、25 kPa水凝膠培養皿及普通塑料24孔板（106kPa）中，于37℃、5%CO2的培養箱中孵育24 h后，順鉑加藥組每孔加入不同濃度的順鉑，終濃度分別為0、5、10、20、40 μmol/L，共同培養24 h后采用CCK-8法行細胞毒性試驗。計算細胞存活率，存活率=（[順鉑加藥組平均吸光度值（optical density，OD）-空白對照組平均OD值）（/陰性對照組平均OD值-空白對照組平均OD值）]×100%，計算不同濃度順鉑作用下HeLa細胞的存活率，并制作細胞毒性曲線，計算出半數抑制濃度（IC50）值。計算IC50公式：lgIC50=Xm-I[P-（3-Pm-Pn）/4]，Xm 為lg 最大劑量，I為 lg最大劑量/相鄰劑量，P為陽性反應率之和，Pm為最大陽性反應率，Pn為最小陽性反應率[7]。

1.3 統計學方法

HeLa細胞增殖活性實驗及其順鉑藥物敏感性實驗中所得數據應用Graphpad Prism軟件繪制細胞存活曲線。

2 結果

2.1 基底剛度對HeLa宮頸癌細胞增殖活性的影響

將相同數量的HeLa細胞接種于不同基底剛度的24孔板中，從接種當天第4小時開始，連續4天（96 h）應用CCK8法測定細胞密度。并根據4～96 h每組細胞的OD值繪制增殖曲線。培養后24、48、72、96 h，隨基底剛度的增加OD值（細胞增殖活性）呈上升趨勢。（圖1）

圖1 不同基底剛度培養皿中HeLa 細胞增殖曲線

2.2 基底剛度對HeLa 宮頸癌細胞順鉑藥物毒性的影響

在同一基底剛度下，HeLa細胞存活率隨順鉑濃度增加而降低。而在相同順鉑濃度下，隨基底剛度的增加HeLa細胞存活率呈下降趨勢（圖2）。根據公式計算出各組IC50值，0.5、5、25 kPa水凝膠培養皿及普通塑料培養皿中HeLa細胞順鉑IC50值分別為137.20、97.62、52.87、18.40 μmol/L。

圖2 不同基底剛度下不同濃度順鉑處理后HeLa細胞的存活率

3 討論

宮頸癌是世界范圍內第二大常見女性惡性腫瘤，在女性與腫瘤相關的死因中，宮頸癌位居第2位。為了提高患者的生存率，婦科腫瘤醫師不斷摸索不同的綜合治療模式，1983年首次報道宮頸癌是化療敏感的腫瘤，目前應用最廣泛的藥物有順鉑或卡鉑、紫杉醇、異環磷酰胺和博來霉素等。對于中晚期及復發性宮頸癌患者，順鉑仍是最有效的姑息性化療藥物[8]。但因患者的個體差異和化療耐藥的問題，宮頸癌患者在同步放化療后的療效存在很大差異，30%～40%的患者在接受標準治療后的兩年內發生了局部復發或遠處轉移[9]。因此，關于中晚期宮頸癌同步放化療如何提高化療敏感性的問題需要進一步系統的研究。

腫瘤微環境中納米力學相關的參數包括剛度、形貌、曲率以及剪應力等，它們對細胞的行為有重要的影響。其中基底剛度是腫瘤微環境中一個重要的力學參數，剛度是指細胞或組織在載荷作用下抵抗彈性變形的能力。基底剛度作為腫瘤微環境中一個很重要的生物力因素，參與細胞的生長、活性、分化和遷移等生物學過程[5-6,10]。細胞為適應其周圍微環境力學性質的改變，其自身黏附能力、遷移能力以及骨架狀態等都會發生相應變化，從而使自身的力學性質也發生改變[11-12]。此前，有關基底剛度對宮頸癌的相關研究較少，故設計了本實驗研究。

3.1 基底剛度對宮頸癌HeLa細胞增殖活性的影響

有研究顯示，基底的力學性能可影響細胞的增殖活性，但并非所有細胞均對基底剛度的改變產生響應[13]。多數細胞傾向于在剛度較大的基底上鋪展面積更大、黏附更好、增殖活性更強；而在較低剛度的基底上鋪展、黏附及增殖情況均較差，甚至不能存活[14]。實驗發現，少數細胞如神經元細胞，在基底剛度較小的培養材料上生長情況更好；另有如中性粒細胞等，其生長狀態及增殖情況受基底剛度改變影響不大，其在3～50 kPa剛度范圍的基底上均能存活[15]。本實驗的研究結果顯示，隨基底剛度的增大，人宮頸癌HeLa細胞的增殖活性更強。

3.2 基底剛度對宮頸癌HeLa 細胞順鉑藥物毒性的影響

基于前述基底剛度對HeLa細胞增殖的研究，進一步探討了在不同基底剛度培養皿中HeLa細胞對順鉑藥物敏感性的差異。本實驗結果顯示，在相同順鉑濃度下，HeLa細胞存活率隨基底剛度的增加呈下降趨勢，即增加基底剛度可提高HeLa細胞對順鉑的敏感性。Feng等[16]有關乳腺癌MCF細胞的體外研究顯示，在剛度較大的基底上乳腺癌MCF細胞對化療藥物順鉑及紫杉醇的藥物毒性反應均有不同程度的增加。Schrader等[17]在基底剛度對肝癌細胞化療敏感性的研究中亦發現，與較小的基底剛度相比，在剛度較大的基底上肝癌細胞對化療藥物的毒性反應更明顯。另有相關研究顯示，與較小剛度的水凝膠相比，在剛度較大的玻璃基底上，順鉑對肺成纖維細胞的效果更明顯[18]。Liu等[19]研究結果顯示，基底剛度的改變亦可影響乳腺癌SK-BR-3細胞對靶向藥物拉帕替尼藥物毒性的響應，即在剛度較大的基底上SK-BR-3細胞對拉帕替尼的藥效更明顯。以上研究結果均提示，腫瘤微環境中力學因素——剛度的改變可能引起腫瘤細胞對藥物反應的差異。

2002年首次提出了“生物力藥理學”的概念[20]。生物力藥理學主要考慮藥物與體內生物力學因素的聯合作用：一方面藥物具有藥效，同時也可能調整體內的生物力學環境；另一方面，生物力學因素可能具有生物學功效，也可能影響藥物代謝與藥效。生物力藥理學是研究藥理學因素（藥物）對體內生物力學因素的干預，也研究生物力學因素對藥效與藥物代謝的影響，以及藥物與力學因素的聯合生物學效應。以往的相關研究以及本研究結果均顯示了基底剛度影響腫瘤細胞對抗腫瘤藥物的反應，這提示腫瘤的藥物治療中需考慮生物力學因素與藥效、藥理的密切關系。基于上述基底剛度可影響腫瘤細胞對抗腫瘤藥物反應的觀點，在體外藥物實驗過程中也應該考慮到剛度這一關鍵的生物力學因素，以達到更好的藥物實驗效果。本研究結果也證明了生物力藥理學的合理性。

通過本研究發現基底剛度的改變不但影響著宮頸癌細胞HeLa的生長，也影響著其對化療藥物的敏感性。因此在宮頸癌的臨床治療中，應考慮到基底剛度改變對腫瘤生長與治療的影響。今后將進一步研究基底剛度改變對HeLa細胞生長、化療敏感性影響的分子生物學機制，如尋找剛度相關基因、力學相關分子靶點、剛度相關信號通路等；并尋找能夠改變腫瘤細胞外力學環境的有效方法，如應用藥物、基因治療等，進而從微環境中的力學因素角度出發，尋找提高宮頸癌化療敏感性的有效方法，提高宮頸癌的臨床治療效果。