LncRNA FTX 對慢性髓細胞性白血病細胞伊馬替尼抵抗的影響及機制研究△

王瑾，馬肖容，劉海玲，姚歡，張卉

西安交通大學第二附屬醫院血液內科，西安 710000

慢性髓細胞性白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）是慢性白血病中最常見的一種類型，患者早期多無臨床癥狀，常因白細胞增多或慢性脾臟腫大而就診。隨著臨床診療技術的發展，骨髓移植和靶向治療藥物在CML的治療中起重要作用。伊馬替尼（Imatinib）作為第一代靶向Bcr-Abl融合基因的酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI），其有效性和安全性均已被證實。然而，伊馬替尼耐藥是CML治療的一個主要問題，嚴重影響了CML患者的臨床療效[1]。因此，明確伊馬替尼耐藥的形成機制對于指導TKI臨床合理應用具有重要意義。隨著基因技術的發展，下調微小RNA（microRNA，miRNA）-451能夠有效改善CML細胞對伊馬替尼的耐藥性，但其具體機制仍未完全闡明[2]。目前，長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）被廣泛研究，其能夠影響編碼蛋白基因的上游啟動子區轉錄、抑制RNA聚合酶的活性、干擾mRNA的剪切等，從而發揮作用。LncRNA FTX屬于LncRNA，與肝癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤的進展及耐藥性的產生密切相關[3-5]。因此，本研究對LncRNA FTX與人CML細胞伊馬替尼抵抗的關系及可能的作用機制進行初步分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器

人CML細胞（K562）、人胚胎腎細胞（293T）均購自美國菌種保藏中心，RPMI 1640、DMEM/F12培養基和胎牛血清均購自美國Gibco公司，1%青霉素-鏈霉素溶液購自上海碧云天生物技術有限公司，CCK-8試劑盒購自美國Hyclone公司，胰蛋白酶、陽離子聚合物均購自美國Sigma-Aldrich公司，轉染脂質體 Lipofectamine?RNAiMAX Reagent、Nanodrop 2000c分光光度計均購自美國Thermo Scientific公司，慢病毒包裝質粒載體pLP-VSVG購自美國Addgene質粒保藏中心，RNA提取試劑RNAiso Reagent、SYBR Green核酸熒光染料和Trizol試劑均購自日本Takara公司，無酶水購自美國Invitrongen公司，多聚嘧啶序列結合蛋白1（polypyrimidine tract-binding protein 1，PTBP1）一抗購自美國Abacm公司，逆轉錄試劑盒、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒均購自上海Roche公司。DM500光學顯微鏡購自德國徠卡相機股份有限公司，酶標儀購自美國Molecular Devices公司，凝膠成像儀、逆轉錄PCR儀均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 將K562和293T細胞接種于75 cm2培養瓶中，采用RPMI 1640或DMEM/F12培養基＋10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液培養，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。傳代時貼壁細胞使用胰蛋白酶消化，加入含血清的培養基終止消化，按照1∶3的比例對細胞進行傳代和培養，取對數生長期的細胞用于后續實驗。

1.2.2 細胞分組 應用間歇濃度梯度遞增法誘導K562細胞對伊馬替尼產生耐藥，采用0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L的伊馬替尼對K562細胞進行分步誘導。在每個濃度梯度下維持培養細胞2周以上，待細胞生長狀態良好后，均在伊馬替尼濃度為4 μmol/L的培養基中篩選，直至細胞可維持生長，繼續培養1周后完成伊馬替尼抵抗組細胞的構建，采用等體積生理鹽水處理CML細胞作為伊馬替尼敏感組。

通過10μlLipofectamine? RNAiMAX 轉 染pLP3-VSVG（每孔 0.45 μg）和 LncRNA FTX（每孔1.5 μg）于293T細胞中，48 h后收集病毒懸液，0.22 μm過濾器過濾懸液，擴增質粒用于后續使用。將收獲的慢病毒感染抵抗組細胞接種于6孔板，采用DMEM/F12培養基+10%胎牛血清+1 ml病毒懸液培養，同時加入3 μl聚凝胺，連續感染2天，氨芐霉素篩選，細胞生長狀態良好。抵抗組細胞轉染LncRNA FTX siRNA慢病毒作為轉染組，構建伊馬替尼抵抗的LncRNA FTX細胞系，并將轉染空白載體的抵抗組細胞作為對照組。

1.2.3 CCK-8法檢測伊馬替尼的IC50值 接種處于對數生長期待測的4組細胞，應用細胞計數儀進行計數，以5000/孔細胞接種至96孔板，培養24 h后，待細胞貼壁完成后，棄上清，加入不同終濃度（0、0.5、1、2、4、8、16、32 μmol/L）的伊馬替尼稀釋溶液，處理48 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，于37℃、5%CO2孵箱中孵育2 h，采用酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度值。按照吸光度值繪制細胞生存曲線，計算細胞的半抑制濃度（halfmaximal inhibitory concentration，IC50）和耐藥指數。

1.2.4 蛋白質印跡法（Western blot）檢測細胞中PTBP1蛋白的相對表達量 將RIPA裂解液與蛋白酶抑制劑PMSF混合后冰上裂解，離心提取，按照1∶5的比例加入上樣緩沖液煮沸。參考目的蛋白配制濃縮膠和分離膠，按照實驗設計，依次上樣，開始電泳。選取20 μl目的蛋白先進行β-actin抗體的電泳（一抗稀釋濃度為1∶400）。再進行PTBP1抗體的孵育，濕轉至聚偏二氟乙烯膜，TBSTw封閉液封閉1 h，一抗4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜，二抗37℃孵育1 h，TBST洗膜，發光液曝光顯影，抗體稀釋濃度依據說明書而定。分析條帶灰度值，以β-actin為內參，計算PTBP1蛋白的相對表達量。

1.2.5 逆轉錄PCR檢測細胞中LncRNA FTX和PTBP1mRNA 的相對表達量 采用逆轉錄PCR檢測4組細胞中LncRNA FTX的表達及轉染組和對照組細胞中PTBP1mRNA的表達水平。采用Trizol提取各組細胞中的總RNA，提取并檢測RNA純度。參考逆轉錄試劑盒說明書將提取后的RNA進行逆轉錄，得到cDNA產物。根據PCR試劑盒說明書進行PCR反應，以β-actin作為內參，并進行定量分析。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞中LncRNA FTX相對表達量的比較

抵抗組細胞中LncRNA FTX的相對表達量為（0.17±0.01），明顯高于敏感組的（0.03±0.01），差異有統計學意義（t=9.746，P＜0.01）。轉染組細胞中LncRNA FTX的相對表達量為（0.03±0.01），明顯低于對照組的（0.18±0.01），差異有統計學意義（t=5.318，P＜0.01）。

2.2 各組細胞伊馬替尼IC50值的比較

CCK-8法檢測結果顯示，伊馬替尼對敏感組、抵抗組、對照組和轉染組細胞的IC50值分別為（1.410±0.096）、（7.060±0.635）、（7.282±0.839）和（3.704±0.285）μmol/L。伊馬替尼對抵抗組細胞的IC50值明顯高于敏感組，差異有統計學意義（t=15.657，P＜0.01）；伊馬替尼對轉染組細胞的IC50值明顯低于對照組，差異有統計學意義（t=10.546，P＜0.01）。

2.3 敏感組與抵抗組細胞中PTBP1蛋白相對表達量的比較

Western blot檢測結果顯示，抵抗組細胞中PTBP1蛋白的相對表達量為（1.02±0.05），明顯高于敏感組的（0.52±0.01），差異有統計學意義（t=6.547，P＜0.01）。（圖1）

圖1 Western blot 檢測敏感組和抵抗組細胞中PTBP1蛋白的相對表達量

2.4 轉染組與對照組細胞中PTBP1蛋白與mRNA相對表達量的比較

Western blot檢測結果顯示，轉染組細胞中PTBP1蛋白的相對表達量為（0.59±0.02），明顯低于對照組細胞的（1.37±0.06），差異有統計學意義（t=1.855，P＜0.01）（圖2）。逆轉錄PCR結果顯示，轉染組和對照組細胞中PTBP1mRNA的相對表達量分別為（2.09±0.22）和（1.96±0.18），組間比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 Western blot 檢測轉染組與對照組細胞中PTBP1蛋白的相對表達量

3 討論

CML主要見于中老年人群，發病隱匿，早期臨床癥狀不明顯，易被忽略，病情進展后可出現巨脾、白細胞增多，導致患者生活質量較差，最終因病情急變而死亡[6]。自TKI藥物問世以來，靶向治療因其高效、安全的特點已逐漸成為CML的一線治療方案。但在應用TKI治療的過程中，部分CML患者會逐漸出現對靶向藥物耐藥的現象，從而影響其遠期療效。目前，關于CML細胞耐藥的具體分子機制尚未完全明確，因此，對其進行研究對CML的治療具有重要意義[7]。

Long等[8]研究發現，LncRNA FTX能夠靶向miRNA-29b-1-5p和Bcl2l2從而調控心肌細胞的凋亡。Yang等[9]研究發現，LncRNA FTX可通過抑制miRNA-215的磷酸化從而促進結直腸癌的進展。Li等[10]研究發現，LncRNA FTX通過促進有氧糖酵解和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的表達從而促進肝細胞癌的惡化。此外，LncRNA FTX在腦膠質瘤中的表達水平較高，并且能夠負反饋調節miRNA-342-3p的表達，促進腦膠質瘤細胞的增殖和侵襲。同時，有研究發現，敲低LncRNA FTX能夠抑制腎癌細胞的增殖、遷移和侵襲，且LncRNA FTX的表達情況對急性髓系白血病的耐藥性具有較大影響[12-13]；上述研究均表明LncRNA FTX與腫瘤的自身特性及其對藥物的耐藥性密切相關。PTBP1屬于異質性核糖核蛋白家族中的一員，在RNA穩定性、選擇性剪切和蛋白降解等方面均發揮作用[14-15]。有研究顯示，下調PTBP1的表達能夠有效調節耐藥性結腸癌細胞的糖酵解過程，減少其對長春新堿的耐藥性[16]。Li等[17]研究發現，miRNA-124/PTBP1/PKM2軸能夠通過Linc-ROR調控胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性。上述研究表明，PTBP1與LncRNA FTX均能夠明顯調控腫瘤細胞對藥物的耐藥性，且LncRNA FTX與PTBP1可能存在相互作用，推測LncRNA FTX可通過調節PTBP1的表達從而改變CML細胞對藥物的耐藥性。然而，目前關于PTBP1與CML關系的研究較少，且PTBP1與LncRNA FTX關系的研究尚未見。

本研究檢測了敏感組和抵抗組細胞中LncRNA FTX的表達情況，結果發現，LncRNA FTX和PTBP1蛋白在抵抗組細胞中的表達均明顯上調，提示LncRNA FTX和PTBP1蛋白可能均與CML細胞對伊馬替尼的抵抗有關，與Shinohara等[18]的研究結果一致。本研究將LncRNA FTX siRNA載體轉染至抵抗組細胞，外源性下調抵抗組細胞中LncRNA FTX的表達，結果發現，伊馬替尼對轉染組細胞的IC50值明顯降低，轉染組PTBP1蛋白的表達明顯下調，而轉染組和對照組細胞中PTBP1mRNA的表達差異不大，提示LncRNA FTX可能通過下調PTBP1蛋白的表達從而降低其穩定性或活性，進一步影響CML細胞對伊馬替尼的敏感性。

綜上所述，LncRNA FTX可能通過調節PTBP1蛋白的表達逆轉人CML細胞對伊馬替尼的耐藥性。后續研究將進一步探討LncRNA FTX與PTBP1蛋白相互作用的具體方式，為臨床伊馬替尼耐藥性的逆轉、靶向藥物的設計以及多種藥物聯合化療的應用提供一個新的思路。