α-平滑肌肌動蛋白在結直腸癌組織中的表達及臨床意義

孫昭，李哲，谷俊杰，楊瑩，白春梅，管梅

中國醫學科學院北京協和醫院腫瘤內科，北京 100730

結直腸癌是常見的消化系統惡性腫瘤，目前，中國每年新發病例數約37萬，其起病隱匿，中國人群的內鏡檢查率相對較低，導致25%的患者明確診斷時已經發生遠處轉移，且約50%可切除的結直腸癌患者會出現復發轉移，因此，結直腸癌每年死亡病例數約20萬。腫瘤微環境中的非腫瘤細胞對腫瘤的進展和預后均具有重要影響，其中，腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblast，CAF）在腫瘤微環境中起重要作用，其主要特征為表達α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）。CAF高表達白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-6、IL-8、IL-10、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、TGF-β、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和趨化因子受體2（C-C motif chemokine receptor 2，CCR2）等炎性因子，可募集多種免疫抑制細胞，形成腫瘤免疫抑制微環境，促進腫瘤細胞的免疫逃逸；也可通過促進腫瘤細胞發生上皮-間充質轉化，從而促進腫瘤細胞的轉移。α-SMA的高表達與乳腺癌、肺癌和口腔癌患者的預后不良均有關[1-3]。結直腸癌組織中也存在大量的CAF，可能與結直腸癌的進展有關，因此，本研究探討α-SMA在結直腸癌組織中的表達情況及其與結直腸癌患者臨床特征和預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年11月至2015年12月于中國醫學科學院北京協和醫院接受手術治療的結直腸癌患者。所有患者均經病理證實為結直腸癌，且均有詳細的臨床資料，均行R0切除術；術后均采用氟尿嘧啶聯合奧沙利鉑的化療方案進行輔助治療；有完整的影像學資料供腫瘤分期評價；有足夠的組織標本供免疫組織化學檢測。本研究共納入103例結直腸癌患者。根據美國癌癥聯合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）頒布的腫瘤TNM分期標準[4]進行分期：Ⅱ期66例，Ⅲ期37例；男49例，女54例；＞60歲76例，≤60歲27例；腫瘤部位：左半結直腸癌25例，右半結直腸癌78例；病理類型：高分化腺癌22例，中分化腺癌70例，低分化腺癌5例，黏液細胞癌5例，印戒細胞癌1例；微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）患者 27例，微衛星穩定（microsatellite stability，MSS）患者67例，無微衛星穩定情況數據患者9例。收集103例結直腸癌患者經手術切除的結直腸癌組織標本。

1.2 免疫組化染色法檢測結直腸癌組織中α-SMA的表達

采用10%的甲醛溶液固定結直腸癌組織，常規進行結直腸癌組織的取材、脫水和石蠟包埋，制作厚度為4 μm的石蠟包埋組織塊。石蠟切片均常規脫蠟至水，0.01 mol/L檸檬酸緩沖液進行微波抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶的活性，山羊血清封閉15 min；加入鼠抗人α-SMA抗體（1∶200稀釋，購自武漢塞維爾生物科技有限公司），4℃冰箱過夜；滴加山羊抗鼠通用抗體（購自丹麥DAKO公司），室溫孵育2 h，采用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對照，以血管平滑肌作為陽性對照；然后切片常規脫水至二甲苯，樹脂封片，在顯微鏡下觀察。

1.3 免疫組化染色結果判定標準

所有石蠟切片的免疫組化檢測結果由2名病理科醫師采用雙盲方法獨立判讀。α-SMA主要表達于結直腸癌中CAF的細胞漿中，陽性染色呈棕色顆粒。隨機選擇5個高倍視野，根據染色強度與陽性細胞所占百分比進行評分。染色強度評分標準：無色為0分，淡棕色為1分，深棕色為2分；陽性細胞所占百分比評分標準：在5個高倍視野下計算染色細胞占視野細胞總數的百分比，陽性細胞＜10%為0分，10%～39%為1分，40%～69%為2分，≥70%為3分。染色強度評分與陽性細胞所占百分比評分相加，總分0～2分為α-SMA低表達，3～5分為α-SMA高表達。

1.4 隨訪

隨訪截止到患者進展，隨訪方式為門診隨訪和電話隨訪，無進展結直腸癌患者的末次隨訪日期為2018年1月。無病生存期指從手術后R0切除開始至有影像學資料證明疾病復發的時間。

1.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存分析采用Log-rank檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中α-SMA 蛋白的表達情況

103例結直腸癌患者中有25例患者α-SMA高表達，78例患者α-SMA低表達。不同性別、年齡、腫瘤部位、病理類型、TNM分期、微衛星穩定性情況結直腸癌患者結直腸癌組織中α-SMA的表達情況比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（圖1、表1）

圖1 α-SMA 在結直腸癌組織CAF 中的表達情況（免疫組化染色，×400）

表1 不同臨床特征結直腸癌患者結直腸癌組織中α-SMA蛋白的表達情況（n=103）

2.2 α-SMA 蛋白表達與結直腸癌患者無病生存情況的關系

截至隨訪結束，78例α-SMA低表達患者中有25例患者進展，3年累積無病生存率為74.4%；25例α-SMA高表達的患者中有12例患者進展，3年累積無病生存率為52.0%。α-SMA低表達結直腸癌患者的無病生存結局優于α-SMA高表達的患者（χ2=4.513，P＜0.05）（圖2）。

截至隨訪結束，亞組分析結果顯示，TNM分期為Ⅱ期的結直腸癌患者中，α-SMA高表達患者的3年累積無病生存率為74.1%，α-SMA低表達患者的3年累積無病生存率為75.0%，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖3）。TNM分期為Ⅲ期的結直腸癌患者中，α-SMA高表達患者的3年累積無病生存率為30.8%，低于α-SMA低表達患者的75.0%，差異有統計學意義（χ2=6.714，P＜0.05）（圖4）。

圖2 α-SMA高表達（n=78）和低表達（n=25）結直腸癌患者的無病生存曲線

圖3 α-SMA高表達Ⅱ期（n=12）和低表達Ⅱ期（n=54）結直腸癌患者的無病生存曲線

圖4 α-SMA高表達Ⅲ期（n=13）和低表達Ⅲ期（n=24）結直腸癌患者的無病生存曲線

3 討論

腫瘤組織中CAF的來源并不十分清楚，可能來源于腫瘤周圍正常組織中固有的成纖維細胞，也可能來源于循環組織或周圍組織中的間充質干細胞[5-6]。結直腸癌組織中存在大量的CAF，CAF可分泌大量的生長因子，如上皮生長因子、肝細胞生長因子和VEGF等，從而激活促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和磷酸肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路，從而促進結直腸癌細胞的增殖，提供結直腸癌細胞生長代謝所需要的物質，誘導腫瘤血管生成和抑制性免疫細胞歸巢，形成有利于腫瘤生長的微環境，促進結直腸癌細胞的侵襲、轉移等[7-12]。因此，CAF與結直腸癌的進展和轉移關系密切，可能成為結直腸癌治療的新靶點。

α-SMA高表達是CAF的主要特征之一，與實體瘤患者的預后不良有關[13]。Tsujino等[14]研究發現，α-SMA高表達、淋巴結轉移均是結直腸癌患者術后復發的獨立危險因素。Valcz等[15]研究發現，腫瘤細胞中E-鈣黏蛋白與α-SMA的表達呈負相關[15]，E-鈣黏蛋白是上皮細胞的重要標志物，其表達下調可能是CAF促進了腫瘤細胞從上皮樣細胞向間質樣細胞轉化的結果。腫瘤細胞發生上皮間充質轉化是腫瘤轉移的重要因素，因此，CAF可能通過促進腫瘤上皮間充質轉化，從而促進腫瘤細胞的轉移。Ikuta等[16]研究發現，α-SMA高表達、膠原沉積是Ⅲ期結直腸癌患者預后較差的分子生物學標志。上述研究結果均與本研究結果存在類似之處。本研究結果顯示，在手術可切除的結直腸癌患者中，α-SMA低表達結直腸癌患者的無病生存結局優于α-SMA高表達的患者（P＜0.05），且α-SMA高表達Ⅲ期結直腸癌患者的3年累積無病生存率低于α-SMA低表達的Ⅲ期結直腸癌患者。α-SMA的表達水平與Ⅱ期結直腸癌患者的無病生存情況無關，這可能是因為Ⅱ期結直腸癌患者的預后本來就好的緣故。另外，結直腸癌組織中α-SMA的表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤部位、病理類型、TNM分期和微衛星穩定性情況均可能無關，從而證明CAF的存在在不同結直腸癌患者群體中可能無明顯差異。但是，α-SMA在Ⅲ期結直腸癌患者中的高表達率為35.1%，高于Ⅱ期結直腸癌患者的18.2%，但差異無統計學意義（P＞0.05），分析其原因可能與本研究納入的病例數較少有關。CAF在惡性腫瘤組織中普遍存在，除了α-SMA是CAF的標志物外，成纖維細胞活化蛋白和波形蛋白等也是CAF的標志物。本研究僅選擇了α-SMA作為CAF的標志物，可能不足以代表全部的CAF群體。另外本研究僅僅說明了在結直腸癌組織中CAF較多的患者的預后更差，但是對CAF促進結直腸癌進展的機制并未揭示，且CAF和結直腸癌細胞之間的相互作用仍需進一步研究。

綜上所述，α-SMA低表達結直腸癌患者的無病生存結局優于α-SMA高表達的患者，且不同α-SMA表達情況的Ⅲ期結直腸癌患者無病生存結局的差異更為顯著，而不同α-SMA表達情況的Ⅱ期結直腸癌患者的無病生存結局無差異。α-SMA可能作為結直腸癌治療選擇和預后預測的分子生物學標志物，而CAF有可能成為結直腸癌治療的新靶點。