金蓮花中8種黃酮類成分的肝微粒體生物轉化研究△

劉雙月，安燕南，劉斯琪，丁鵬敏，王青青，龐月笙，王如峰

北京中醫藥大學 生命科學學院，北京 102488

金蓮花(Flos Trollii)為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花TrolliuschinensisBunge的干燥花，主要含黃酮類、酚酸類和生物堿類成分，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抑菌等活性[1-2]。黃酮類化合物含量最高，約占金蓮花干質量的18%[3-4]，金蓮花中大部分黃酮類化合物為黃酮碳苷，例如葒草素、牡荊素、異當藥黃素、金蓮花碳苷Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ及其衍生物等。除黃酮碳苷外，還有黃酮醇及氧苷類成分，如槲皮素、異槲皮素等[5-11]。這些化合物的生物活性及體內代謝情況對確定金蓮花的有效成分研究具有重要的作用。雖然黃酮類化合物的代謝研究報道較多[12-14]，但是這些研究大多集中于黃酮氧苷的代謝，而由于黃酮碳苷在植物中的分布相對較窄，其代謝研究特別是肝代謝研究卻鮮有報道。肝臟是代謝的主要器官，其中富含代謝酶系，肝微粒體細胞色素P-450酶系(CYP450)是其中催化藥物生物轉化的主要酶系統，可發生Ⅰ相代謝，如氧化、還原、水解等反應以及Ⅱ相代謝，如葡萄糖醛酸、硫酸和氨基酸等軛和反應[15]。目前肝微粒體轉化模型在藥物體外代謝研究中被廣泛應用，該方法可排除體內諸多干擾因素，專一地模擬研究藥物在肝臟內的代謝情況。鑒于此，本研究采用大鼠肝微粒體轉化模型分別對金蓮花中的牡荊素、葒草素、葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷、異當藥黃素、日本異當藥素、2″-O-(2?-甲基丁酰基)異當藥黃素、金蓮花碳苷Ⅰ和異槲皮素等8種黃酮類成分的肝臟代謝過程進行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters高效液相色譜儀；Thermo LTQ ORBITRAP XL質譜儀；勻漿器(德國IKA)；超速離心機CP100WX(株式會社日立制作所)；氮吹儀(北京市優晟聯合科技有限公司)；AE240十萬分之一電子天平(Mettler公司)；渦旋混勻器(海門市氣林貝雨儀器廠)；水浴振蕩器(金壇市華立實驗儀器廠)。

氧化型輔酶Ⅱ(NADP)、還原型輔酶Ⅰ(NADH)、葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PDH)均購于Sigma公司；二硫酸蘇糖醇(DTT)購于北京拜爾迪生物技術有限公司；苯巴比妥鈉注射液購于中國中醫科學院望京醫院；氯化鉀、氯化鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸乙酯、甲醇、乙腈均購于北京高華偉業食品添加劑有限公司；Folin-酚試劑盒購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司；金蓮花黃酮類化合物均為本實驗室分離、鑒定得到的單體化學成分，結構見圖1。

圖1 金蓮花中8種黃酮類化合物的結構式

1.2 實驗動物

清潔級SD大鼠，20只，體質量(220±20) g，由北京大學醫學部實驗動物中心提供，合格證編號：SCXK(京)2006-0008。

1.3 大鼠肝微粒體的制備

SD大鼠20只，每天腹腔注射一次苯巴比妥鈉0.9%氯化鈉溶液(按80 mg·kg-1劑量)，連續注射3 d。禁食12 h，自由飲水，于第4天脫頸椎處死，快速解剖取出大鼠肝臟。參照文獻方法[16]，采用二次離心法制備大鼠肝微粒體。制備的肝微粒體溶液分裝，-80 ℃保存，備用。

1.4 肝微粒體的總蛋白濃度測定

按照Lowry法，測定大鼠肝微粒體中蛋白濃度，以梯度濃度的牛血清白蛋白(BSA)作標準液測定吸光度值并制作濃度(X)-吸光度值(Y)標準曲線，得到回歸方程Y=0.968 1X+0.033 9，r=0.999 1，線性范圍0.025～0.25 mg·mL-1。以水溶液代替樣品作空白對照，據上述結果計算，所制備的微粒體蛋白質量濃度為22.8 mg·mL-1。

1.5 肝微粒體的CYP450酶含量及活性測定

采用CO還原差示光譜法測定CYP450酶含量[17]，結果所測CYP450蛋白的濃度為0.55 nmol·mL-1。以CYP450酶能氧化氯唑沙宗生成6-羥基氯唑沙宗為原理進行活性驗證，用HPLC測定轉化結果[18]，從而間接地證明所制備的肝微粒體具有CYP450酶活性。

1.6 肝微粒體模型體外代謝轉化實驗

精密稱取各單體化合物，溶于適量磷酸鹽緩沖液(50 mmol·L-1KH2PO4-K2HPO4，pH 7.4)中，配制成底物化合物原液。采用酶法再生輔酶NADPH系統，用磷酸鹽緩沖液配制輔酶體系(包括1.0 mmol·L-1NADP，0.5 mmol·L-1NADH，10 mmol·L-1G-6-P，1.0 IU·mL-1G-6-PDH和4.0 mmol·L-1MgCl2)。在配制的輔酶體系中定量加入肝微粒體(滅活組：將肝微粒體于80 ℃水浴加熱處理10 min)，搖勻后，37 ℃水浴中溫孵5 min，定量加入底物化合物反應，實驗反應體系見表1。反應2 h后加入等體積預冷的乙酸乙酯終止反應。

表1 肝微粒體模型體外代謝反應體系 mL

1.7 液質聯用色譜檢測

1.7.1 檢測樣品預處理 將反應終止后的樣品在16 162×g離心10 min，除去肝微粒體，加入等體積乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，氮氣吹干。再加入1 mL甲醇超聲溶解，0.22 μm微孔濾膜過濾，待HPLC-LTQ Orbitrap MS檢測。

1.7.2 色譜/質譜條件 Phenomenex色譜柱(250 mm×4.6 mm，4 μm)，流動相乙腈-水，流速1.0 mL·min-1，進樣量10 μL，各組待測樣本分別按照適應的流動相比例梯度洗脫。Thermo LTQ Orbitrap XL質譜儀，Accela 600 泵，電噴霧離子源(ESI)，負離子掃描模式，掃描范圍m/z：100～800。毛細管溫度350 ℃，毛細管電壓-35 V，氣化溫度300 ℃，鞘流氣流量17 L·min-1。

1.8 數據處理

將肝微粒體轉化組與空白組和對照組的總離子流圖進行對比(見圖2)，新增加的峰推測可能為代謝產物，根據質荷比獲得代謝產物峰的提取離子流圖，對各產物的一級質譜和二級質譜碎片信息進行數據庫檢索及分析。

注：A.牡荊素；B.葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷；C.異當藥黃素；D.2″-O-(2?-甲基丁酰基)異當藥黃素；E.金蓮花碳苷Ⅰ；F.異槲皮素；G.葒草素；H.日本異當藥素；A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1、D2、D3、D4、E1、E2、E3、F1、F2為各代謝產物；a.空白對照組；b.陰性對照組；c.滅活對照組；d.轉化組。 圖2 金蓮花中8種黃酮類化合物肝微粒體轉化的總離子流圖

圖3 已確定結構的黃酮類化合物肝微粒體代謝產物的結構圖

2 結果與分析

2.1 金蓮花黃酮類化合物質譜裂解規律分析

對底物化合物的LC-MS數據進行分析，歸納出8種黃酮類化合物在質譜電噴霧離子源(ESI)系統中易斷裂的部位及形成的碎片，見表2。黃酮碳苷類主要是以糖環內部的斷裂為主要斷裂形式，單六碳糖碳苷主要脫去m/z90和120的碎片，產生典型的[M-C3H6O3-H]-和[M-C4H8O4-H]-碎片離子，雙糖碳苷主要脫去m/z120、90和60的碎片離子。由于碎片離子結構中含有羰基，質譜圖中常見丟失CO的小分子碎片離子。衍生物先斷掉衍生取代基后會按照母核的斷裂方式繼續斷裂黃酮碳苷部分及苷元部分，O-糖基或O-甲基丁酰基不穩定，會優先碎裂。當C-7位有甲氧基時，易發生脫甲基斷裂。這與研究報道的黃酮化合物裂解規律一致。

表2 金蓮花中8種黃酮類化合物的質譜碎片信息

化合物分子量分子式準分子離子m/z二級碎片離子m/z牡荊素432.38C21H20O10431.10[M-H]-341.00[M-C3H6O3-H]- ([M-H-90]-)、311.02[M-C4H8O4-H]-([M-H-120]-)、283.09[M-C4H8O4-CO-H]- ([M-H-120-28]-)葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷610.15C27H30O16609.14[M-H]-519.07[M-C3H6O3-H]- ([M-H-90]-)、489.09[M-C4H8O4-H]-([M-H-120]-)、429.06[M-C4H8O4-C2H4O2-H]-([M-H-120-60]-)、369.19[M-C6H12O6-C2H4O2-H]-([M-H-180-60]-)、309.07[M-C6H12O6-C4H8O4-H]- ([M-H-180-120]-)、357.03、327.05、298.96異當藥黃素446.40C22H22O10445.12[M-H]-325.06[M-C4H8O4-H]- ([M-H-120]-)、297.01[M-C4H8O4-CO-H]- ([M-H-120-28]-)、282.00[M-C4H8O4-CO-CH3-H]-([M-H-148-15]-)2″-O-(2?-甲基丁酰基)異當藥黃素530.52C27H30O11529.17[M-H]-445.05[M-C5H8O-H]-([M-H-84]-)、427.12[M-C5H8O-H2O-H]-([M-H-84-18]-)、337.12[M-C5H10O2-C3H6O3-H]-([M-H-102-90]-)、307.01[M-C5H10O2-C4H8O4-H]-([M-H-102-120]-)金蓮花碳苷Ⅰ546.17C27H30O12545.17[M-H]-461.09[M-C5H8O-H]-([M-H-84]-)、443.03[M-C5H8O-H2O-H]-([M-H-84-18]-)、353.07[M-C5H10O2-C3H6O3-H]-([M-H-102-90]-)、323.04[M-C5H10O2-C4H8O4-H]- ([M-H-102-120]-)異槲皮素464.38C21H20O12463.09[M-H]-445.05[M-H2O-H]- ([M-H-18]-)、301.04[M-C6H10O5-H]- ([M-H-162]-)葒草素448.38C21H20O11447.10[M-H]-357.04[M-C3H6O3-H]-([M-H-90]-)、327.07[M-C4H8O4-H]-([M-H-120]-)、298.96[M-C4H8O4-CO-H]- ([M-H-120-28]-)日本異當藥素462.41C22H22O11461.11[M-H]-341.07[M-C4H8O4-H]- ([M-H-120]-)、312.94[M-C4H8O4-CO-H]-([M-H-120-28]-)、298.00[M-C4H8O4-CO-CH3-H]-([M-H-148-15]-)

表3 金蓮花中8種黃酮類化合物肝微粒體代謝轉化產物檢測結果

2.2 代謝轉化產物結構特征分析

牡荊素(vitexin)，分子式C21H20O10，分子量432.38。經肝微粒體轉化后有兩個轉化產物(A1和A2)。轉化產物A1，保留時間14.18 min，準分子離子峰m/z473.11[M-H]-，分子式C23H22O11，推測其為牡荊素的乙酰化產物。其二級碎片離子m/z431.06[M-H-42]-為脫去乙酰基后形成，m/z341.14為[M-H-42-90]-，m/z353.14為[M-H-120]-，m/z311.04為[M-H-120-42]-，m/z283.00為[M-H-120-42-28]-，碎片離子及斷裂方式與牡荊素一致，推測其乙酰化的位置可能在糖苷的2位或黃酮母核上。轉化產物A2，保留時間10.38 min，準分子離子峰m/z447.09[M-H]-，分子式C21H20O11。黃酮類B環是發生代謝反應的主要部位，B環上沒有或僅有1個羥基時，易被代謝成3′，4′-二羥基黃酮[19]。根據反應規律，推測是牡荊素發生羥基化反應生成了葒草素，其產生的二級碎片離子m/z357.18[M-H-90]-，327.10[M-H-120]-，與葒草素碎片離子及斷裂方式一致。

葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷(2″-O-β-L-galactopyranosylorientin)，分子式C27H30O16，分子量610.15。經肝微粒體轉化后得到兩個轉化產物(B1和B2)。轉化產物B1，保留時間11.83 min，準分子離子峰m/z771.20[M-H]-，分子式C33H40O21，推測其為糖基化產物。其二級碎片離子m/z591.21[M-H-180]-很可能是丟失C6H12O6中性碎片后形成，碎片離子m/z489.29、369.01、357.07、327.06與葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷碎片離子一致，推測其是增加了一個六碳糖，但糖基化位置無法確定。轉化產物B2，保留時間16.43 min，準分子離子峰m/z651.16 [M-H]-，分子式C29H32O17，推測其為乙酰化產物。其二級碎片離子m/z609.27是其脫掉乙酰基后形成，m/z519.13、489.09是半乳糖部分斷裂形成，m/z471.11是其丟失180(-C6H12O6)后形成，m/z429.08為繼續脫掉乙酰基后形成。另外，碎片離子m/z357.11和327.01與葒草素的碎片一致，說明產物的乙酰化位置不在半乳糖上，也不在糖苷上，很可能在黃酮母核上。

異當藥黃素(isoswertisin)，分子式C22H22O10，分子量446.40。經肝微粒體轉化后有兩個轉化產物(C1和C2)。轉化產物C1，保留時間12.69 min，準分子離子峰m/z431.10[M-H]-，分子式C21H20O10，推測其為異當藥黃素脫掉甲基后生成的牡荊素。其二級碎片離子m/z341.07、311.00和282.99與牡荊素碎片離子及斷裂一致。轉化產物C2，保留時間18.08 min，準分子離子峰m/z487.13[M-H]-，分子式C24H24O11，推測其為異當藥黃素的乙酰化產物。其二級碎片離子m/z445.15為脫去乙酰基后形成，m/z427.13為[M-H-60]-，m/z325.00為[M-H-42-120]-，m/z297.02為[M-H-42-148]-，m/z282.04為繼續丟失CH3碎片，不能確定乙酰化位置。

2″-O-(2?-甲基丁酰基)異當藥黃素[2″-O-(2?-methylbutyryl)isoswertisin]，分子式C27H30O11，分子量530.52。經肝微粒體轉化后有4個轉化產物(D1～D4)。其中有3個不同保留時間的準分子離子峰為m/z545.17[M-H]-的轉化產物，且其分子式均為C27H30O12，推測是在不同位置發生了羥基化，生成3個產物D1、D2和D3。轉化產物D1，保留時間為13.33 min，準分子離子峰為m/z545.17[M-H]-，二級碎片離子m/z461.14、443.09、353.07和323.05為連續丟失84、18、90和120碎片而形成，根據文獻[20]推測其為金蓮花碳苷Ⅰ，如圖3所示的結構。另外兩個m/z545.17[M-H]-的準分子離子峰，保留時間分別為11.60(轉化產物D2)和11.96 min(轉化產物D3)，由于2?-甲基丁酰基上可以發生ω氧化或ω-1氧化反應，且二級碎片離子中都有m/z501和445，其三級碎片離子中有m/z427、337、307碎片，且對m/z501進行二級掃描發現產生有m/z427、337、307碎片，與2″-O-(2?-甲基丁酰基)異當藥黃素斷裂一致，推測為2″-O-(2?-甲基-4?-羥基丁酰基)異當藥黃素(2″-O-(2?-methyl-4?-hydroxybutyryl)isoswertisin)和2″-O-(2?-甲基-3?-羥基丁酰基)異當藥黃素(2″-O-(2?-methyl-3?-hydroxybutyryl) isoswertisin)，見圖3所示的結構。轉化產物D4，保留時間12.34 min，準分子離子峰m/z515.16[M-H]-，分子式C26H28O11，推測其為脫甲基產物。其二級碎片離子m/z431.28為[M-H-84]-，是脫去了甲基丁酰基后形成，m/z413.09可能為繼續脫去一分子水，m/z311.08為[M-H-84-120]-，推測其為2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素(2″-O-(2?-methylbutyryl)vitexin)，見圖3所示的結構。

金蓮花碳苷Ⅰ(trollisin I)，分子式C27H30O12，分子量546.17。經肝微粒體轉化后有3個轉化產物(E1～E3)。轉化產物E1，保留時間12.71 min，準分子離子峰m/z587.18[M-H]-，分子式C29H32O13，推測其為乙酰化產物。其二級碎片離子m/z545.16為其脫去乙酰基后形成，m/z503.08為其脫去甲基丁酰基后形成，m/z485.08為[M-H-42-60]-，碎片離子m/z443.13、353.12和323.06與金蓮花碳苷Ⅰ碎片一致，說明乙酰化部位不在甲基丁酰基上。轉化產物E2和E3的準分子離子峰為m/z561.16[M-H]-，分子式C27H30O13，保留時間分別為9.02 min(轉化產物E2)和9.28 min(轉化產物E3)。由于2?-甲基丁酰基上可以發生ω氧化或ω-1氧化反應，轉化產物E2和E3的二級碎片離子中都有m/z517、461、443、353和323，與金蓮花碳苷Ⅰ斷裂一致，推測分別為2″-O-(2?-甲基-4?-羥基丁酰基)日本異當藥素(2″-O-(2?-methyl-4?-hydroxybutyryl)isoswertiajaponin)和2″-O-(2?-甲基-3?-羥基丁酰基)日本異當藥素(2″-O-(2?-methyl-3?-hydroxybutyryl) isoswertiajaponin)，見圖3 所示的結構。

異槲皮素(isoquercitrin)，分子式C21H20O12，分子量464.38。經肝微粒體轉化后有兩個轉化產物(F1和F2)。轉化產物F1，保留時間15.41 min，準分子離子峰m/z505.10[M-H]-，分子式C23H22O13，推測其為乙酰化產物。其二級碎片離子m/z463.13為[M-H-42]-，m/z445.05為[M-H-42-18]-，m/z301.04為[M-H-42-162]-，不能確定乙酰化位置。轉化產物F2，保留時間11.55 min，準分子離子峰m/z625.14[M-H]-，分子式C27H30O17，推測其為糖基化產物。其二級碎片離子m/z462.94為[M-H-162]-，m/z301.03為[M-H-162-162]-，不能確定糖基化位置。

葒草素(orientin)，分子式C21H20O11，分子量448.38。葒草素與牡荊素A環結構相同，肝微粒體轉化形式相似，但由于轉化組和滅活組均檢測到了準分子離子峰為m/z489.11[M-H]-，分子式為C23H22O12的物質，不能確定其是否發生了乙酰化，可能是滅活的體系殘留一定的酶活性造成的。

日本異當藥素(isoswertiajaponin)，分子式C22H22O11，分子量462.41。日本異當藥素比異當藥黃素多一個羥基，A環結構相同，理論上會發生脫甲基反應，但由于對照品中有準分子離子峰為m/z447.10[M-H]-，分子式為C21H20O11的物質，不能確定其是否發生了脫甲基反應。

3 討論

本研究中肝微粒體可促進黃酮苷類化合物發生羥基化、乙酰化、糖基化以及脫甲基反應，說明建立的肝微粒轉化模型中不止發生了I相代謝，也發生了以乙酰化和糖基化反應為代表的Ⅱ相代謝。黃酮碳苷類化合物，在C-8位通過C-C鍵將苷元和糖鏈連接，C-苷鍵不易水解，實驗中沒有直接脫糖的產物生成，異槲皮素是黃酮氧苷類化合物，容易發生O-苷鍵的水解，但實驗中未能找到直接脫糖的轉化產物。化學成分經大鼠肝微粒體轉化后，發生的羥基化、脫甲基和糖基化反應，會使轉化產物的極性增強，有利于化合物的排泄，減少化合物的體內存留時間，降低毒性。酰化反應后，黃酮類化合物的脂溶性和水溶性提高，并能促進脂肪及類脂代謝[21]。本實驗中，金蓮花黃酮類單體成分在大鼠肝微粒體模型中轉化率較低，所以沒有檢測到大量的新產物生成。代謝反應中存在化合物相互轉化的現象，說明金蓮花的部分藥理活性很可能是由其原形化合物產生的，例如牡荊素、葒草素等[22-23]是已經報道的金蓮花中活性較強的成分。

黃酮苷類化合物在腸道中較難吸收，主要在肝臟部位發生生物轉化[14]。肝臟代謝的主要作用是對進入機體的外源性化學成分進行結構修飾，使其易于排出體外，同時化學成分經生物轉化后的藥理活性變化復雜，可能進一步產生活性成分，增強藥效或產生毒性成分等。金蓮花中的化學成分被機體吸收后，可直接到達靶器官發揮藥效，或者通過代謝組織代謝產生的活性產物來發揮藥效。本文采用大鼠肝微粒體轉化模型模擬肝臟代謝過程，對金蓮花中黃酮類單體成分進行了轉化研究，并采用液質聯用技術對轉化產物進行了結構分析，可進一步為金蓮花成分的體內代謝途徑研究和確定活性成分等奠定基礎，也對黃酮類化合物新藥開發及臨床應用具有指導意義。