多指標綜合加權評分法優選清感退熱湯加減方的提取工藝△

張春艷，李玥，楊莎莎，成睿珍

1.天津市濱海新區中醫醫院，天津 300450；2.天津中醫藥大學，天津 300193

清感退熱湯加減方是天津市濱海新區中醫醫院兒科廣泛使用的臨床經驗方，由“清感退熱湯”作為基礎方進行加減而成。清感退熱湯經過多年臨床實踐，結合理論辨證施治，已取得了良好的療效，以本方為基礎的加減方已治療了數百例患者[1]。

研究表明，不同的提取工藝會對湯劑的療效產生不同程度的影響[2-3]。然而，作為兒科常用藥，清感退熱湯加減方目前尚未有較為完善的提取工藝。為了明確清感退熱湯的提取工藝，確保其質量和臨床療效，本文對加減方中君藥葛根，臣藥黃芩的有效成分進行測定，以葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的含量為指標，采用正交試驗結合綜合加權評分法優化清感退熱湯的提取工藝，為研發穩定、可行、質量可控的清感退熱湯提取工藝提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Alltech 1500系列Q 05型高效液相色譜儀；Agilent Eclipse C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；UV-6100 PCS型紫外可見分光光度計(上海美普達有限公司)；FA 2104型精密電子分析天平(上海舜宇恒平科技儀器有限公司)；JE 1001型電子天平(上海浦春計量儀器有限公司)；KDM調溫電熱套(山東省鄄城精佳儀器有限公司)；SB 25-12 DT超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 試藥

黃芩苷對照品(批號：MUST-11101403)、漢黃芩苷對照品(批號：MUST-16111611)、葛根素對照品(批號：MUST-11043001)均購于成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥98%；甲醇、乙腈色譜純(天津市康科德科技有限公司)；磷酸為優級純(天津市江天化工技術有限公司，純度≥98%)；實驗用水為娃哈哈純凈水。

中藥飲片由天津市濱海新區中醫醫院藥學科提供，經劉海副主任中藥師鑒定，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》的規定。

2 方法與結果

2.1方法學的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱Agilent Eclipse C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇(A)-0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脫(見表1)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長270 nm；柱溫為常溫；進樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品葛根素0.9 mg、黃芩苷2.9 mg、漢黃芩苷1.0 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 稱取處方飲片：葛根10 g，黃芩10 g，生石膏30 g等，共108 g。回流提取并用300目濾布對提取液進行過濾。取1 mL濾液置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 陰性供試品溶液的制備 按處方比例稱取除黃芩或除葛根以外的其余藥材，按2.1.3項下方法制備，分別制得無黃芩的陰性供試品溶液和無葛根的陰性供試品溶液。

2.1.5 專屬性試驗 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定。結果表明此方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

注：A.混合對照品；B.供試品；C.無葛根的陰性供試品；D.無黃芩的陰性供試品；1.葛根素；2.黃芩苷；3.漢黃芩苷。圖1 對照品及供試品溶液HPLC圖

2.1.6 標準曲線的繪制 精密量取上述混合對照品儲備液，用甲醇逐級稀釋，制成一系列不同濃度的對照品溶液，按照2.1.1項下色譜條件進樣，以色譜峰面積(Y)為縱坐標，進樣量(X)為橫坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算。葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的回歸方程分別為Y=3×109X-96 526(r=0.999 9)，Y=2×109X-215 803(r=0.999 9)，Y=5×109X-75 545(r=0.999 7)；線性范圍分別為：0.09～0.72、0.29～5.8、0.04～0.24 μg。結果表明，葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷在其相應的線性范圍內線性關系良好。

2.1.7 精密度試驗 精密吸取高、中、低3種不同濃度的葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷對照品溶液，按2.1.1項下的色譜條件連續進樣5次，測定3種成分的峰面積，計算各成分的含量，求得日內精密度，其RSD值分別為0.46%、0.13%、0.52%。

取同一對照品溶液連續進樣3 d，測定峰面積，計算各成分的含量，求得日間精密度，其RSD值分別為0.12%、0.09%、0.36%。結果表明，實驗儀器的日間日內精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗 取處方按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣，測定葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷3種成分的峰面積，計算各成分的含量，其RSD值分別為0.77%、0.21%、0.47%。結果表明，供試品溶液在室溫下24 h內穩定。

2.1.9 重復性試驗 取處方按2.1.3項下方法制備供試溶液6份，按2.1.1項下色譜條件分析，測定葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷3種成分的峰面積，計算各成分的含量，其RSD值分別為0.68%、0.42%、0.54%，結果表明，此法重復性良好。

2.1.10 回收率試驗 精密量取已知含量的供試液6份，分別加入等量的對照品，按2.1.3項下方法制備供試品溶液，按2.1.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算加樣回收率。求得葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的加樣回收率分別為100.10%、99.63%、101.01%，其RSD值分別為0.68%、1.44%、1.09%。結果表明，此方法加樣回收率良好。

2.2 最佳提取工藝的優選

2.2.1 單因素考察 按處方量稱取藥材，分別加入6、8、10倍量水，均回流提取1次，每次1 h，平行3份。按2.1.1項下色譜條件分析，測定3種成分的峰面積并計算各成分的含量，求得葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的提取量分別為：10倍量水22.5、81.64、8.91 mg·g-1(RSD值分別為1.27%、1.75%、1.81%)；8倍量水25.53、78.99、8.17 mg·g-1(RSD值分別為0.85%、0.09%、0.05%)；6倍量水19.87、66.38、7.24 mg·g-1(RSD值分別為0.41%、0.39%、0.32%)。

2.2.2 多指標成分權重分析 按照處方中君臣佐使及含量進行分析，將葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的權重系數分別定為0.6、0.2、0.2。

綜合評分=(葛根素含量/葛根素最大含量)×100×0.6+(黃芩苷含量/黃芩苷最大含量)×100×0.2+(漢黃芩苷含量/漢黃芩苷最大含量)×100×0.2

(1)

2.2.3 正交設計 采用正交設計IIV3.1優選最佳工藝，選擇3因素3水平(見表2)，按L9(34)正交設計進行試驗。以處方中主要藥材的主要有效成分作為測定指標，采用加權綜合評分法，對實驗結果進行數據統計，以指標成分的含量和綜合評分值對實驗結果進行直觀分析(見表3)和方差分析(見表4)，確定最佳提取工藝。

表2 因素水平表

表3 正交試驗結果

表4 綜合評分方差分析

由表2的R值直觀分析和表3方差分析可知，各考察因素對考察指標影響大小的次序為C>A>B，其中加水量(A)差異有統計學意義(P<0.10)，提取次數(C)差異有統計學意義(P<0.05)，而提取時間(B)在實驗所設范圍內無差異。綜合正交設計結果、時間和成本問題，得出最佳試驗方案為A2B1C3，即8倍量水，提取0.5 h，提取3次。

2.2.4 驗證實驗 按處方量比例稱取同一批藥材，平行3份，按優化的最佳提取工藝進行提取，測得葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的質量分數分別為37.35、135.58、15.53 mg·g-1，RSD分別為1.06%、0.13%、0.19%。結果表明，該工藝穩定可行。

3 討論

3.1 流動相的選取

有關葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的含量測定，經查閱文獻[4-7]發現，研究者多用乙腈、甲醇作為有機相，實驗中選取了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水作為流動相。實驗發現當選用甲醇-0.1%磷酸水作為流動相時，在相同的分離時間內各峰的峰形和分離度均較好。

3.2 波長的選取

分別取葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷對照品溶液，用紫外可見分光光度計檢測出各指標成分的最大吸收波長分別為239、279、270 nm。因葛根素和其他成分的最大吸收峰差距較大，故分別選取240、245、250、255、260、265、270、275 nm作為檢測波長，對供試品溶液進行分析。實驗發現，270 nm下葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷的峰面積響應值相對較大，故以270 nm作為檢測波長。

3.3 權重系數的選取

本實驗通過對主要藥味的有效成分進行含量測定，根據復方中不同藥味的地位分配權重，進行多指標成分權重分析。葛根甘、辛、涼，有解肌退熱，生津止渴等功效，可協助柴胡透汗解熱，主要用于外感發熱惡寒無汗、項背強痛等，為方中君藥，故將葛根素權重系數定為0.6。黃芩苦寒，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效[8]，能清瀉上焦肺火、除腸中濕熱，為方中臣藥，有效成分為黃芩苷和漢黃芩苷，故其權重系數分別定為0.2和0.2。

3.4 提取工藝的確定

通過表3中的R值，直觀分析得出的最佳工藝是A2B3C3，即8倍量水，提取1.5 h，提取3次。由表3方差分析表可知，提取時間在實驗所設范圍內對實驗結果無影響，從時間和成本方面考慮，最終選擇最短提取時間0.5 h，從而得出最佳工藝為A2B1C3。

本文首次測定了清感退熱湯中葛根素、黃芩苷和漢黃芩苷3種有效成分的含量，并優化了提取工藝。研究表明，本法簡便、靈敏、重復性好，可用于清感退熱湯加減方的質量控制，以確保臨床療效；提取工藝穩定可行，為進一步開發利用該處方提供了參考。