當歸成藥期次生代謝產物含量變化與早期抽薹相關性研究△

白貞芳，李萌，王杰，詹雪艷

北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488

中藥當歸為傘形科植物當歸Angelicasisnensis(Oliv.)Diels的干燥的根，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便等功能，是常用的大宗藥材[1]。目前商品當歸以栽培品為主，一般栽培當歸兩年才能藥用，但部分栽培當歸植株第二年就提前開花，這種現象叫早期抽薹；早期抽薹的當歸根部無法進行正常的次生生長，沒有形成油室去產生大量的揮發油，根的柴性增強，從而喪失了其藥用價值。據了解，當歸在道地產區甘肅岷縣正常年份的當歸抽薹率為10%～30%，而嚴重時高達到80%以上，有時甚至全部早期抽薹。已有學者從當歸種子質量、育苗方式、種苗大小、移栽方式及外源激素等多方面進行了大量探索和實踐，但因防控技術難度大導致至今沒有根本性突破，早期抽薹仍是影響當歸質量和產量的重要因素[2-10]。

本研究采用高效液相色譜法和紫外分光光度法測定兩年生栽培當歸不同生長時期根和地上部分阿魏酸和多糖含量[11-13]，探討了當歸不同生長期、不同部位中阿魏酸與多糖的含量變化與當歸早期抽薹的相關性，為深入研究當歸早期抽薹機制提供實驗依據。

1 材料

島津LC-20AT高效液相色譜儀、UV檢測器、CTO-10AS柱溫箱、SIL-20A自動進樣器；BY45-YXS數顯恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司)；AL204電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；WFJ2000紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器有限公司)。

阿魏酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：20140301)；葡萄糖(上海源葉生物科技有限公司，批號：SA0418GA14)；纖維素酶(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20131223)；甲醇、乙醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

實驗材料栽培在甘肅岷縣當歸栽培基地，從2017年5月出現早薹苗時開始收集材料，每月收集1次，分別收集正常當歸和早期抽薹當歸的根及地上部分，陰干。共收集5批樣品，見表1。

表1 實驗材料

2 方法與結果

2.1 阿魏酸含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為XDS-C18柱，流動相為乙腈和0.085%磷酸水溶液比例為(17∶83)；測定波長：316 nm；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.1.2 標準曲線制備 精密稱取阿魏酸對照品6.28 mg置于50 mL容量瓶中，用70%的甲醇將阿魏酸溶解并定容至50 mL，得到質量濃度為0.125 6 mg·mL-1的儲備液。分別精密吸取儲備液0.1、0.4、0.8、1.2、1.6 mL分別置于10 mL容量瓶中，并用70%甲醇將儲備液定容至10 mL，在進樣前用0.45 μm濾膜過濾，進樣量為10 μL，檢測，得阿魏酸線性回歸方程，保留時間為15.458 min。依據HPLC的峰面積(Y)和阿魏酸質量濃度(X)進行回歸分析，得方程Y=43 178X-2 682.7，r=0.999 5，表明當阿魏酸在1.256～20.096 μg·mL-1與峰面積呈良好的線性關系(圖1)。

注：A.正常當歸根部提取物；B.正常當歸葉提取物；C.阿魏酸對照品。圖1 當歸及阿魏酸對照品HPLC圖

2.1.3 供試品溶液制備 取0.2 g當歸粉末(過60目篩)，精密稱定后置具塞錐形瓶中，精密加入20 mL 70%甲醇，稱質量，加熱回流30 min，放冷，再稱質量。減失質量用70%甲醇補足，0.45 μm濾膜濾過，取濾液供阿魏酸測定。

2.1.4 精密度試驗 準確取阿魏酸對照品溶液10 μL，迸樣5次，得阿魏酸相對保留時間的RSD為0.17%，計算阿魏酸峰面積的RSD為0.28%，表明精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 準確稱取當歸0.2 g，同時制備供試液5份，以10 μL進樣，記錄各色譜圖，測定峰面積，計算阿魏酸含量，RSD為2.26%，表明重復性良好。

2.1.6 穩定性試驗 準確稱取當歸0.2 g制備供試液，分別于 0、2、4、6、8、10、12 h進樣10 μL。記錄各色譜圖，測定其峰面積，對照品在不同時間點峰面積的RSD為 0.31%，含量的RSD為0.31%，結果表明供試品溶液中阿魏酸在12 h內穩定。

2.1.7 回收率試驗 準確稱取實驗樣品0.2 g 5份，分別加入阿魏酸對照品82.43 μg，按樣品測定方法提取和測定。得回收率為101.46%(n=5)，RSD為0.98%(見表2)。

表2 當歸中阿魏酸加樣的回收率(n=5)

2.1.8 含量測定 準確稱取待測各實驗樣品0.2 g，每個實驗樣品同時制備供試液2份，在上述已建立的HPLC條件下檢測，外標標準曲線法計算樣品中阿魏酸含量，兩次實驗數據的平均值作為每個實驗樣品中阿魏酸含量，各批次樣品中阿魏酸含量的變化見圖2～3。

圖2 正常根和抽薹根中阿魏酸含量趨勢

2.2 多糖含量測定方法的建立

2.2.1 標準曲線制備 將精密稱取的8.87 mg葡萄糖對照品溶解在50 mL容量瓶中，并用蒸餾水定容，得儲備液(質量濃度為0.177 4 mg·mL-1)。分別精密吸取儲備液 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL定容于2 mL容量瓶中，即得葡萄糖對照液(質量濃度分別為0.035 48、0.053 22、0.070 96、0.088 70、0.106 64 mg·mL-1)。分別吸取1 mL上述標準液，置于1～5號具塞試管中，加2.0mL的5%苯酚溶液，搖勻，再加7.0 mL濃硫酸混勻，沸水浴加熱20 min，室溫冷卻。蒸餾水空白對照。測定不同濃度的標準溶液在490 nm處的吸光度，繪制標準曲線。回歸方程Y=0.068 1X-0.016 8，r=0.999 6，說明質量濃度3.548～10.664 μg·mL-1葡萄糖與吸光度呈良好線性關系。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取 2.0 g 當歸粉末(過40目篩)以及6.40 mg纖維素酶于 5 只 50 mL 錐形瓶中，各加 8 倍量的蒸餾水，將溶液 pH 值調至 5.0，60 ℃浸泡提取 4 h，再置于 100 ℃水浴 10 min 將酶滅活，放置至室溫。抽濾后，濾液中加入1/5 體積的Sevage 試劑，混合振蕩后除去有機層，重復6～7次，當水相和有機相之間不再出現白色沉淀后，將水相移至50 mL容量瓶中定容備用。

2.2.3 精密度試驗 準確量取葡萄糖對照品溶液1.0 mL，稀釋至2.0 mL，顯色后測量吸光度，重復5次，得RSD為0.17%。表明該對照品精密度良好。

2.2.4 重復性試驗 稱取當歸各2.0 g，制備供試液5份，稀釋150倍，精密量取供試品溶液1.0 mL，測定吸光度。記錄吸光度，以葡萄糖來計算供試品中多糖的含量，RSD為0.97%，表明重復性良好。

2.2.5 穩定性試驗 精密稱取當歸2.0 g制備供試液，準確量取供試品溶液1.0 mL，分別于顯色后0、12、24、48、72 h，測定吸光度，計算其含量RSD為1.46%。說明供試品顯色后72 h內穩定。

2.2.6 回收率試驗 準確稱取實驗樣品1.0 g和葡萄糖0.3 g，制得供試液5份，測定吸光度，得回收率98.68%(n=5)，RSD為4.34%(見表3)。

表3 當歸中葡萄糖的回收率(n=5)

2.2.7含量測定 分別取實驗樣品，按照上述方法測定吸光度，利用葡萄糖的標準曲線來計算多糖含量，不同批次的樣品中多糖的含量以葡萄糖來計，結果見圖4～5。

圖4 正常根及抽薹根中多糖含量變化趨勢

圖5 正常葉及抽薹葉中多糖含量變化趨勢

3 結論與討論

當歸不同生長時期根和地上部分中阿魏酸的含量存在顯著差異。正常當歸根中阿魏酸的含量，5月份含量較高，隨著時間推移，其含量逐漸遞減，8月份時，阿魏酸含量最低，9月底到10月初含量突然急劇增高。正常當歸葉中阿魏酸含量變化趨勢相反，先增加后減少，6—7月份含量最高，9月底采收的當歸葉中阿魏酸含量無法測到。通常，阿魏酸含量隨遮陽率的升高而增加[5]，而9月份正是當歸采收期，正值日照漸短之際，相當于遮陽率升高，阿魏酸向根部積累，這可能是9月30號采收的這批樣品，正常根阿魏酸含量出現反向增長的原因。抽薹當歸根中阿魏酸含量，隨著生長周期的推移其含量漸漸減小，5月份剛剛抽薹時，阿魏酸含量較高，到6月底這段時間，根中阿魏酸含量急劇下降；從6月底—9月底，低水平的阿魏酸含量基本保持不變(圖2)，抽薹當歸葉中阿魏酸含量在整個生長周期中基本保持在較低的水平(圖3)。這可能是由于6月份植株體內大量的營養成分用于抽薹，當歸根部得不到充足的營養而無法進行正常代謝活動，導致根部柴性增強，有效成分阿魏酸也不能繼續積累，故抽薹后當歸根部阿魏酸含量保持低水平的不變。

正常當歸與抽薹當歸不同部位阿魏酸含量有一定差異。5—8月，兩者根部阿魏酸含量相當，9月底，正常當歸根部阿魏酸含量顯著高于抽薹當歸(圖2)。通常當歸在 6—7月份進入抽薹期[5]，此時正常當歸葉中阿魏酸含量高于抽薹當歸，8月底兩種當歸已完成開花，8—9月底兩者葉中阿魏酸含量均處于較低水平，不存在顯著差異(圖3)。當歸開完花后，抽薹當歸的根部處于木質化狀態，產生次生代謝產物阿魏酸能力很低，而開完花后正常當歸仍具有正常的生理活性，代謝產物阿魏酸在其根部積累增長，故9月份抽薹當歸根部阿魏酸含量仍處于較低水平，正常當歸根部阿魏酸含量顯著高于抽薹當歸。

正常當歸根中多糖含量9月份之前變化幅度不大，而9月份這一個月內多糖含量急劇增加。說明9月份根是生長中心，光合作用產生的大量營養物質涌向根部并積累，確保了根的正常發育和代謝產物的積累。抽薹當歸根中的多糖含量都隨時間推移基本呈趨于穩定(圖4)。這可能是當歸開始抽薹后，生長中心是地上部分，植物光合作用產生的大部分營養物質積聚在地上部分，加快了當歸生長發育的進程，出現了早期抽薹現象，此時抽薹當歸根部處于木質化中，無法產生充足的代謝產物(如多糖)，故抽薹當歸根中多糖含量隨時間推移變化不大。

正常當歸葉中多糖含量在5—9月份隨時間推移而緩慢降低，說明在成藥期，葉片產生的營養物質主要供給當歸其他部位的生長發育，可能前期供給當歸開花，花期完成后供給根部，導致根部多糖含量9月份出現增長。抽薹當歸葉中多糖含量隨時間推移呈現先減后增的趨勢，5月底到8月底，多糖含量緩慢降低，到9月底，多糖含量又突然增高(圖5)。這可能是因為當歸開始抽薹時，大部分營養物質用于開花，故7、8月份抽薹葉多糖含量很低。而9月份當歸已完成開花過程，不需要太多的營養物質，但由于抽薹當歸此時根部已經木質化，光合作用產生的營養物質貯存在葉片中，故這時抽薹當歸葉中多糖含量出現增加現象。

正常當歸與抽薹當歸根部和葉中多糖的含量存在顯著差異。正常當歸根部的多糖含量顯著高于抽薹當歸(圖4)，而在5—8月份兩者葉中多糖含量相當，9月份抽薹當歸葉中多糖含量出現急劇增加，顯著高于正常當歸葉中的含量(圖5)。兩種當歸在9月已完成開花，此時抽薹當歸根部處于木質化狀態，營養物質主要在葉中貯藏，故抽薹當歸葉中多糖含量顯著升高，而正常當歸此時營養物質主要在根部積累，因此正常當歸葉中多糖含量仍處于一個較低穩定水平，遠遠低于抽薹當歸葉片中多糖的含量，而抽薹當歸葉片中多糖含量出現增長的現象。

栽培當歸的早期抽薹嚴重影響次生代謝產物積累，對當歸藥材的產量和質量都有很大程度的制約，阻礙了當歸資源的可持續發展。前人研究發現，通過篩選種子和種苗、控制育苗時間、改動栽培方式等措施可不同程度降低當歸早期抽薹率。雖然研究取得了一定的成果，但目前早期抽薹仍是當歸生產和發展的主要制約因素。本項目初步探討了栽培當歸在第二年生長過程中阿魏酸和多糖含量與早期抽薹的之間的關系，要準確了解當歸生長過程中次生代謝產物與抽薹的關聯性，還需要重復驗證，這也是本項目后續研究的內容之一。