HPLC-MS/MS同時測定鮮鐵皮石斛中141種農藥及代謝物殘留△

王鵬思，吳佩玲，薛健

中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193

鐵皮石斛為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥莖。11月至翌年3月采收，可加工成“鐵皮楓斗(耳環石斛)”和“鐵皮石斛”[1]。現代研究表明鐵皮石斛主要含有芪類、酚類、多糖、氨基酸、木質素類等成分，具有增強免疫、降血糖、抗腫瘤等藥理作用[2-3]。鐵皮石斛野生資源已瀕臨枯竭，但“救命仙草、藥界大熊貓”鐵皮石斛的需求量卻越來越大，因此我國一些科研機構和種植公司為滿足這種需求，經過近20年的研究和探索，實現了鐵皮石斛種苗繁育和人工栽培技術的突破性進展。目前鐵皮石斛主要是通過人工種植的方式進行生產，在此過程中極易發生病蟲害，藥農難免會使化學農藥進行防治[4-6]。但由于藥農缺乏病蟲害防治相關基礎知識和常識，常常是依照農藥經銷商的推薦意見購買和使用農藥，導致農藥亂用濫用現象普遍，嚴重威脅藥材的質量和產區生態安全[7]。

目前，關于鐵皮石斛中的農藥殘留多采用氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)[8-9]、氣相色譜-火焰光度檢測器(GC-FPD)[10]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[11]、氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)[12-13]等，液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[14]雖有報道，但僅測定了8種有機磷農藥，總體測定農藥品種偏少，難以較全面地了解鐵皮石斛中的農藥殘留狀況，從而無法對鐵皮石斛中的殘留農藥進行較全面的風險評估。

鮮鐵皮石斛未經加工、炮制，作為藥食同源物質，采收后可直接鮮食，且易于人體吸收，價格較低，適合大眾消費。因此，本研究以鮮鐵皮石斛為研究基質，建立了鮮鐵皮石斛中141種農藥及代謝物的HPLC-MS/MS檢測方法，從而為更加真實、全面地了解鐵皮石斛中的農藥殘留狀況提供一種簡便快捷、經濟節約、穩定耐用的多殘留分析方法，該方法也可為相關部門對鮮鐵皮石斛藥材的安全監測提供重要參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜串聯AB SCIEX 5500 QTRAP質譜儀(配電噴霧離子源ESI源)；Milli-Q超純水機(美國Millipore公司)；PL203型電子天平(瑞士梅特勒)；VORTEX-5旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；TDZ5-WS低速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；LABOROTA4000/4型旋轉蒸發器(德國海道夫)。

1.2 試劑與材料

乙腈(HPLC級，美國Fisher公司)；乙腈、冰醋酸(HAc)(分析純，北京化工廠)；甲酸(LC-MS級，上海安譜實驗科技股份有限公司)；無水硫酸鎂、無水乙酸鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；超純水；141種農藥及其代謝物(100 mg·L-1)均購自中國農業部環境保護科研監測所；空白鮮鐵皮石斛樣品經中國醫學科學院藥用植物研究所張本剛研究員鑒定為為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的新鮮莖。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1 混合儲備液 分別準確吸取適量單一對照品溶液(100 mg·L-1)，用色譜乙腈稀釋，制成各農藥組分質量濃度均為500 ng·mL-1的混合儲備液，保存于-18 ℃冰箱中。

2.1.2 基質匹配對照品溶液 按照2.2項下樣品前處理步驟制備不含目標化合物的空白基質溶液，準確吸取適量混合儲備液，用基質溶液作為稀釋溶劑制成質量濃度分別為1、2、5、10、20、40、60、80、100 ng·mL-1的基質匹配對照品溶液。

2.2 樣品前處理

取供試品，粉碎成漿狀，取約5 g，精密稱定，置50 mL具塞離心管中，準確加入10 mL 1%乙酸乙腈，渦旋3 min，加入1 g無水乙酸鈉，渦旋混勻，再加入1 g 無水硫酸鎂，立即搖散，并渦旋1 min，離心(4000 r·min-1)5 min，精密吸取上清液1 mL，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，即得。

2.3 分析條件

2.3.1 色譜條件 C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.9 μm)；流速：0.2 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：2 μL；流動相A：色譜乙腈，流動相B：0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序為：0～0.5 min，70%～70%B；0.5～9 min，70%～10%B；9～13 min，10%～10%B；13～13.1 min，10%～70%B；13.1～18 min，70%～70%B。分析時間：18 min。

2.3.2 質譜條件 以三重四級桿串聯質譜儀檢測，電噴霧(ESI)離子源，監測模式為多反應監測(MRM)；掃描方式：正離子(131個化合物)和負離子(10個化合物)同時掃描，離子噴霧電壓(IS)+5.5 kV；離子噴霧電壓(IS)-4.5 kV；離子源溫度550 ℃，霧化氣(GS1)：50 psi(1 psi≈6.895 kPa)，輔助氣(GS2)：50 psi，氣簾氣(CUR)：35 psi，各化合物參考保留時間、監測離子對、去簇電壓(DP)、碰撞電壓(CE)見表1。

表1 141種農藥及代謝物的保留時間、質譜參數

續表1

續表1

2.4 方法學驗證

2.4.1 方法的線性和靈敏度 將2.1.2項下配制的基質匹配對照品溶液在2.3項下分析條件下進樣，以各農藥的質量濃度X為橫坐標，以各農藥的定量離子對應的峰面積Y為縱坐標繪制校正曲線。結果顯示，141種農藥在各自的線性范圍內呈現良好的線性關系，r均≥0.995 0(見表2)。本研究通過向空白鐵皮石斛樣品中添加不同量的農藥混合對照品溶液以制備多個較低水平(1、2、5、10 μg·kg-1)的加標樣品，按照2.2項下樣品前處理制備供試品溶液并在2.3項下分析條件下進行測定，以信噪比(S/N)大于或等于10時的最低添加水平為該農藥的定量限(LOQ)。結果(見表2)可知，各化合物的定量限均在1～10 μg·kg-1。

表2 141種農藥及代謝物方法學驗證數據

續表2

2.4.2 方法的回收率和精密度 準確稱取空白鐵皮石斛樣品5.0 g于50 mL具塞離心管中，分別添加適量的500 μg·L-1的混合儲備液，制備10、20、50 μg·kg-13個濃度水平(每個水平重復3次)的添加樣品，放置30 min以上，按照正文2.2項下中“準確加入1%乙酸乙腈10 mL”開始至樣品前處理完成。為減小基質效應的影響，同時制備空白鐵皮石斛基質溶液，并配制10、20、50 μg·L-1的基質混合對照品溶液作為計算回收率的對照溶液。由表2知，除滅蠅胺、吡蚜酮、甲基硫菌靈、聯苯肼酯外，其余137種農藥及代謝物的回收率均在60.0%～120.0%，RSD均<20%，n=3。

《GB/T 27417-2017 合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》中指出添加質量濃度水平<0.1 mg·kg-1時，回收率在60.0%～120.0%即可，王京輝等[15]指出多殘留分析(一次需要分析數十、甚至上百種農藥)中60%～140%的回收率范圍是可以被接受的。因此，本研究所建立的方法符合農藥多殘留分析的要求。

3 討論

3.1 農藥品種的選擇

本研究依據以下原則，遴選出了目前對于中藥材鐵皮石斛具有監測意義并且適于HPLC-MS/MS檢測的141種農藥品種。這些原則是：1)中華人民共和國農業部第194、199、274號等公告中明令禁止或限制在中藥材種植中使用的農藥(http：//www.foodmate.net/law/dongtai/177625.html)，如涕滅威、殺撲磷、甲磺隆等；2)通過文獻調研[4-6]和實地調研等方式，針對性地選取防治鐵皮石斛病蟲害的常用農藥品種，如多菌靈、吡蟲啉、苯醚甲環唑等；3)部分有毒理學意義的農藥代謝物，如3-羥基克百威、特丁硫磷亞砜等；4)參考《美國藥典》《歐洲藥典》等規定的植物藥中有關農藥殘留檢測品種，如二嗪磷等。

3.2 前處理條件的確定

3.2.1提取溶劑的選擇 丙酮、乙酸乙酯和乙腈是樣品中多農藥殘留分析的常用提取溶劑。其中，丙酮易提取樣品中的色素等雜質，且丙酮與水互溶，難以與水相分層。乙酸乙酯極性小，用其進行提取時大部分極性農藥難以轉移到有機相中，且易提取基質中的蠟質、脂肪等非極性雜質[16-17]。丙酮和乙酸乙酯還均易揮發，有刺激性氣味，對人體健康危害較大。而乙腈作為提取溶劑時，可萃取較寬范圍極性的多農藥殘留，且可避免基質中的蠟質、脂肪等親脂雜質的干擾。《中華人民共和國藥典》《中華人民共和國國家標準》《AOAC Official Method》(2007.01)《BS EN 15662：2008》等公認的多農藥殘留測定法中也均選用乙腈作為提取溶劑，因此本研究選用乙腈作為提取溶劑。此外，本研究涉及農藥包括有機磷類、氨基甲酸脂類、磺酰脲類等多種類別的農藥，多數農藥在偏酸性條件下較穩定，在堿性條件下易分解。因此，在乙腈中加1%乙酸，與鹽析時加入的乙酸鈉構成緩沖體系，可增強酸堿敏感性農藥在乙腈提取液中的穩定性[18]。

3.2.2 凈化與否的確定 分散固相萃取法(d-SPE)是QuEChERS法中采用的凈化方法。分散固相萃取法使用較多的凈化劑材料有PSA、C18、GCB等。但經過前期研究和文獻[19-20]發現PSA類吸附劑對甲磺隆、氯磺隆、胺苯磺隆等含羧基農藥的吸附性較強以致此類農藥難以回收。而GCB也會導致片狀結構農藥的回收率降低[21]。因此采用2.2項下不凈化的前處理方法進行了鮮鐵皮石斛20 μg·kg-1的添加回收實驗(n=3)，結果表明20 μg·kg-1添加水平下不凈化即可滿足大多數(138個)農藥回收率在60%～120%，且方法靈敏度高，更具有操作簡便、快速、經濟節約等優點，因此確定的樣品前處理方法為無需凈化的方法。

另外，本研究為降低基質效應的影響，采用了空白樣品基質提取液來稀釋農藥對照品溶液，測定時可使樣品溶液和對照品溶液的離子化條件更加接近，從而確保分析結果的準確可靠。

4 結論

本研究建立了鐵皮石斛藥材中141種農藥及其代謝物殘留快速檢測的HPLC-MS/MS方法，經驗證該方法操作簡便、靈敏度高、選擇性好，為鐵皮石斛藥材中多類別農藥殘留的例行檢測、風險評估等研究提供了一種高效、可靠的分析手段。