HPLC同步測定麩炒枳殼配方顆粒特征圖譜與柚皮苷 橙皮苷 新橙皮苷含量△

姚娜，黃燕明，李雪銀，陳桂生，康志英，2

1.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣東 廣州 510663；2.寧夏隆德縣六盤山中藥資源開發有限公司，寧夏 固原 756300

麩炒枳殼配方顆粒是以麩炒枳殼飲片為原料，經過水提、真空濃縮之后將濃縮液干燥成提取物，將提取物加適量輔料制備成顆粒后進行包裝制備而成。原料麩炒枳殼為枳殼經炮制后加工制成。生枳殼具有理氣寬中、行滯消脹的功能，臨床上用于胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內停、臟器下垂，麩炒后增強了健脾消脹作用[1-2]。枳殼中包含揮發油、黃酮類、少量香豆素及生物堿等[3-4]，其中柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷是主要的有效成分。生枳殼經炮制后，柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷含量會有顯著變化[5-9]。已有文獻大多是單獨測定枳殼或麩炒枳殼飲片及其復方制劑的主成分含量，該方法不能同時適用于指紋圖譜，且關于麩炒枳殼中藥配方顆粒的質量標準也尚未統一。為了有效控制和評價麩炒枳殼制備而來的配方顆粒產品的質量，本研究利用HPLC建立同步測定麩炒枳殼配方顆粒特征圖譜和定量檢測指標成分柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的方法[10-18]。

1 材料

1.1 儀器

超純水器(Simplicity，美國密理博Millipore公司)；超聲機(KQ500DE，昆山市超聲儀器有限公司)；Ultimate 3000 DGLC高效液相色譜儀；Agilent 1260高效液相色譜儀；十萬分之一電子分析天平(MS205DU，瑞士Mettler toledo公司)。

1.2 試藥

枳殼對照藥材(中國食品藥品檢定研究院，批號：120981-201104，規格：0.5 g/瓶)；柚皮苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：110722-201312，純度：94.7%)；新橙皮苷(中國食品藥品檢定研究院，批號：111857-201102，純度：99.6%)；橙皮苷(中國食品藥品檢驗研究院，批號：110721-201316，純度：95.3%)；乙腈和磷酸色譜級；甲醇分析純。

10批顆粒成品均來自廣州市香雪制藥股份有限公司(批號分別為201806001～201806010)。

2 方法和結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

使用C18色譜柱；以乙腈為流動相A，水(用磷酸調節pH值至3)為流動相B，0～20 min，流動相A為22%、流動相B為78%，20～30 min，流動相A為22%～90%，流動相B為78%～10%；波長為283 nm。理論塔板數以柚皮苷峰計，不低于3000。

2.2 對照品溶液的制備

取柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成混合對照品溶液，其中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷質量濃度分別為80、4、40 μg·mL-1。

2.3 供試品溶液的制備

取成品約0.1 g，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，并加入50%甲醇100 mL，稱質量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)15 min，冷卻后再稱質量，用50%甲醇補回減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 測定法

對照品溶液與供試品溶液進樣各10 μL，記錄色譜圖。

2.5 測定結果

10批麩炒枳殼配方顆粒的柚皮苷質量分數為83.12～86.04 mg·g-1，平均質量分數為84.48 mg·g-1，橙皮苷質量分數為3.683～4.761 mg·g-1，平均質量分數為4.133 mg·g-1，新橙皮苷質量分數為46.00～47.61 mg·g-1，平均質量分數為46.73 mg·g-1；10批麩炒枳殼配方顆粒指紋圖譜中有5個色譜峰能穩定重現，故確立了5個特征峰，其中2號峰鑒定為柚皮苷，3號峰鑒定為橙皮苷，4號峰鑒定為新橙皮苷。

注：2.柚皮苷；3.橙皮苷；4.新橙皮苷。圖1 10個批次麩炒枳殼配方顆粒成品HPLC疊加圖

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性試驗 取配方顆粒成品、麥芽糊精及枳殼對照藥材分別按2.3項下方法制備，按2.1項下的色譜條件測定，結果表明，5個共有色譜峰的鑒定均不受溶劑及輔料等因素干擾，方法專屬性良好。

注：A.空白溶劑；B.枳殼對照藥材；C.輔料；D.麩炒枳殼配方顆粒成品；2.柚皮苷；3.橙皮苷；4.新橙皮苷。圖2 麩炒枳殼配方顆粒成品特征圖譜專屬性試驗

2.6.2 精密度試驗 取同一批麩炒枳殼配方顆粒制備的供試品溶液，按2.1項下的色譜條件于高效液相色譜儀上連續進樣6次，記錄色譜圖。以2號峰柚皮苷峰為參照，計算相對保留時間，結果其RSD值為0.00%～0.16%，各主要色譜峰的相對保留時間基本無差異，表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復性試驗 取同一個批次的麩炒枳殼配方顆粒樣品，平行6份，按2.3項下方法制備，按2.1項下方法分別進樣，記錄色譜圖。以2號峰柚皮苷峰為參照，計算各圖譜的相對保留時間，RSD值為0.00%～0.11%，表明方法的重復性良好。

2.6.4 穩定性試驗 取某一批麩炒枳殼配方顆粒供試品溶液，按2.1項下方法，分別在0、2、4、6、8、12、29、48 h進樣，記錄色譜圖。以2號峰柚皮苷峰為參照，計算相對保留時間，各圖譜特征峰相對保留時間的RSD值為0.00%～0.96%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.6.5 中間精密度試驗 分別考察不同分析人員、不同日期、不同設備對精密度的影響，結果RAD在0.00%～0.87%，表明該方法精密度良好。

2.6.6 耐用性試驗 取同一批麩炒枳殼配方顆粒供試品，分別使用Agilent Zorbax Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Elite Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Welch Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)3種型號的色譜柱測定，記錄色譜圖。以2號峰柚皮苷峰為參照，RSD<3.28%，表明該方法耐用性良好。

2.6.7 相對保留時間規定值的確立 經不同色譜柱及不同設備考察，供試品的色譜圖中柚皮苷峰與相應的參照物峰保留時間相同，以柚皮苷峰為S峰，計算特征峰1、3、4、5的相對保留時間，根據不同條件相對保留時間變化情況確定規定值情況如下：峰1為0.85、峰3為1.09、峰4為1.30、峰5為2.00，且偏差控制在±5%以內。

2.7 含量測定方法學考察

2.7.1 線性關系及范圍 取混合對照品溶液(柚皮苷：77.65 μg·mL-1，橙皮苷：3.869 μg·mL-1，新橙皮苷：42.51 μg·mL-1)，采用自動進樣器分別進樣0.5、1、2、5、10、15、20 μL，柚皮苷進樣量為0.038 8、0.077 6、0.155 3、0.388 2、0.776 5、1.164 8、1.553 0 μg，在283 nm下測定，以柚皮苷峰面積積分值對柚皮苷對照品的進樣量進行回歸分析，其回歸方程為：Y=21.8X-0.013，r=1，結果表明柚皮苷在0.038 8～1.553 0 μg，與峰面積呈良好線性關系。橙皮苷進樣量為0.001 9、0.003 9、0.007 7、0.019 3、0.038 7、0.058 0、0.077 4 μg，在283 nm下測定，以橙皮苷峰面積積分值對橙皮苷對照品的進樣量進行回歸分析，其回歸方程為：Y=21.792X-0.010 4，r=0.999 9，結果表明橙皮苷在0.001 9～0.077 4 μg，峰面積呈良好線性關系；新橙皮苷進樣量為0.021 2、0.042 5、0.085、0.212 6、0.425 1、0.637 6、0.850 2 μg，在283 nm下測定，以新橙皮苷峰面積積分值對新橙皮苷對照品的進樣量進行回歸分析，其回歸方程為：Y=23.909X-0.017，r=1，結果表明，新橙皮苷在0.021 2～0.850 2 μg，濃度與峰面積呈良好線性關系。

2.7.2 重復性試驗 同2.6.3項下，并對所得數據進行處理，柚皮苷平均質量分數為84.30 mg·g-1，RSD為1.29%；橙皮苷平均質量分數為3.68 mg·g-1，RSD為1.01%；新橙皮苷平均質量分數為46.46 mg·g-1，RSD為1.15%，結果表明該方法重復性良好。

2.7.3 穩定性試驗 同2.6.4項下，對所得峰面積數據進行處理并計算RSD。柚皮苷對照品溶液和供試品溶液的RSD分別為0.29%、0.31%；橙皮苷對照品溶液和供試品溶液的RSD分別為1.85%、0.32%；新橙皮苷對照品溶液和供試品溶液的RSD分別為0.20%、0.37%，表明麩炒枳殼配方顆粒供試品溶液及柚皮苷、新橙皮苷以及橙皮苷對照品溶液在48 h內穩定性良好。

2.7.4 加樣回收率 精密稱取已測柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量的麩炒枳殼配方顆粒適量，平行9份，分別精密加入低、中、高濃度的柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷對照品，按供試品項下操作，依法測定，平均回收率分別為98.86%、99.21%、99.66%，RSD分別為2.11%、2.21%、1.52%，結果表明該方法回收率良好。

2.7.5 中間精密度試驗 同2.6.5項下，柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷含量的RAD在0.01%～1.83%，表明該方法中間精密度良好。

2.7.6 耐用性試驗 同2.6.6項下測定，柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷含量的RSD為0.67%～2.09%，表明該方法耐用性良好。

3 討論

本試驗對比了50%甲醇與純甲醇作為溶劑的區別：溶劑為純甲醇時，會引起溶劑與流動相不匹配現象，導致產生嚴重的前沿峰，使峰面積比正常峰面積小，為消除這種影響，對照品和供試品制備時采用50%的甲醇溶解，峰形良好，相同進樣量情況下，響應值顯著提高，檢測更為靈敏。故研究方法采用50%甲醇作為對照品和供試品溶液配置的溶劑。

在柚皮苷、新橙皮苷和橙皮苷的含量測定中，對其定量下限進行研究。混合對照品溶液(柚皮苷質量濃度：77.65 μg·mL-1，橙皮苷質量濃度：3.869 μg·mL-1，新橙皮苷質量濃度：42.51 μg·mL-1)適量，進樣0.5 μL，依法測定。橙皮苷峰信噪比約為10∶1時，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的進樣量分別為0.038 8、0.021 2、0.001 9 μg，連續進樣5次，柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷RSD依次為1.85%、1.21%、1.42%。即確定本含量測定方法的定量下限為柚皮苷0.038 8 μg、橙皮苷0.001 9 μg、新橙皮苷0.021 2 μg。

綜上所述，本實驗中建立HPLC能夠實現同步測定麩炒枳殼配方顆粒特征圖譜與柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量，且該方法經方法學驗證，適用性良好，可以作為麩炒枳殼配方顆粒質量控制和評價的依據之一。