紫萁貫眾中流感病毒神經氨酸酶抑制劑的篩選△

郎爽，閆艷韜，劉暢，楊錦，王子健，高增平*

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100102；2.北京中醫藥大學，北京中醫藥研究院，北京 100029

流感病毒為正粘病毒科帶有節段、單股負鏈RNA基因組的包膜病毒，分為甲(A)、乙(B)、丙(C)3型，其中甲型流感病毒宿主范圍較廣，在傳播過程中易發生變異，對人類的健康造成極大的威脅[1-3]。神經氨酸酶(neuraminidase，NA)是流感病毒表面的一種包膜糖蛋白，其與流感病毒的復制和傳播過程關系密切，NA抑制劑主要是通過抑制神經氨酸酶的活性，來阻斷流感病毒的生命周期[4]。因NA活性位點在A、B型流感病毒中均高度保守，設計研發神經氨酸酶抑制劑類藥物可以同時治療A、B型流感，這使得NA成為抗流感病毒藥物研究中的理想靶點[5-7]。隨著對奧司他韋、扎那米韋等NA抑制劑耐藥的流感病毒株的出現[8]，開展新型NA抑制劑的研究十分重要。紫萁貫眾為紫萁科紫萁屬植物紫萁OsmundajaponicaThunb的干燥根莖和葉柄殘基，味苦，性微寒，能清熱解毒，止血殺蟲，用于疫毒感冒，熱毒瀉痢，癰瘡腫毒等，收載于2015年版《中華人民共和國藥典》一部。現代藥理研究結果表明，紫萁貫眾具有抗病毒、抗菌、抗癌、提高機體免疫力等作用[9]，但有關其抗流感病毒NA活性的研究鮮有報道。本研究擬運用分子對接技術將紫萁貫眾中的化合物進行抗流感病毒活性虛擬篩選，同時候選化合物抑制NA活性通過神經氨酸酶抑制實驗來驗證，從而在紫萁貫眾中篩選出流感病毒NA抑制活性最好的單體，為尋找新的抗流感病毒藥物奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 研究應用軟件

繪圖軟件：ChemDraw Ultra 8.0、Chem 3D Ultra 8.0；對接軟件：AutoDock Vina、AutoDock Tools 1.5.6、LigPlus 和PyMOL。

1.2 藥物與試劑

無水氯化鈣、氫氧化鈉、冰醋酸(北京化工廠)；甘氨酸(Biotech)；2-N-嗎啡林-乙磺酸(MES，Sigma)；甲型H1N1流感病毒(A/California/04/2009)；神經氨酸酶(北京 Sino Biological Inc.公司)；磷酸奧司他韋膠囊(羅氏制藥有限公司)；MUNANA(2′-4-Methylumbellifery-α-N-acetylneuraminic acid，Sigma公司)；紫萁酮(批號：111888-201001，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院)，異銀杏素(批號：PRF9092901，純度≥98%，成都普瑞法有限公司)。

1.3 主要儀器

MS300磁力攪拌器(上海般特儀器有限公司)，恒溫培養箱(上海福瑪實驗設備有限公司)，超凈工作臺(上海力申科學儀器有限公司)，分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)，數字式酸度計(德國賽多利斯股份公司)，SpectraMax I3X熒光酶標儀(美國Molecular Devices公司)，移液器(德國Eppendorf股份公司)，黑色底透96孔板(美國Costar公司)。

2 方法

2.1 紫萁貫眾中NA抑制劑的虛擬篩選

2.1.1 配體準備 將23個紫萁貫眾中的單體化合物(Z1～Z23)(見表1)，應用ChemDraw Ultra 8.0畫出其二維結構，保存格式為mol；再通過Chem 3D Ultra 8.0轉化為三維結構，通過MM2力場進行能量最優化，保存格式為pdb；最后應用Autodock Tools對小分子配體進行加氫、加電荷、計算電荷，保存為pdbqt文件備用。

表1 紫萁貫眾中23個化合物的類別、編號及名稱

2.1.2 流感病毒靶蛋白的篩選與處理 對接研究采用的病毒蛋白晶體結構來源于PDB數據庫(http：//www.rcsb.org/pdb/home/home.do)，在PDB數據庫下載復合有已知活性化合物(原配體)的NA為靶蛋白受體，共18個包括9個NA亞型(N1～N9)，見表2。用UCSF Chimera及MGL Tools 1.5.6軟件對蛋白質晶體結構進行處理，對蛋白質進行去水、加極性氫、加電荷、修改電荷，生成pdbqt文件備用。

2.1.3 分子對接參數的確定使用 UCSF Chimera軟件將晶體結構中的原始配體提取出來，再利用Autodock Vina將原始配體對接回處理好的受體蛋白結合位點，利用MGL Tools軟件建立格點能量圖參數文件。根據原配體的坐標文件設置Grid Box中心坐標，設置盒子大小使預對接的分子在它最伸展的狀態下也能在盒子內轉動，且能包括原配體與受體相互作用的所有氨基酸，其他參數均為默認值，生成格點文件備用。

表2 與流感疾病相關的神經氨酸酶(NA)靶蛋白受體

2.1.4 分子對接 AutoDock Vina軟件會綜合考慮小分子配體的位置、角度及可旋轉鍵等因素進行對接計算，得出化合物與靶蛋白的結合能，對接參數均為默認值，其過程是尋找配體與受體在活性位點結合處結合能較低的構象。利用Ligplus 軟件觀察紫萁貫眾中篩選的化合物與NA中相互作用的氨基酸殘基及疏水作用基團。

2.2 候選化合物的神經氨酸酶抑制實驗

采用經典的底物熒光法進行酶活性測定[10]。實驗設置空白對照組、模型對照組、陽性對照(奧司他韋)組、候選化合物組，每組設5個重復孔。各組反應體系所加試劑見表3。

表3 NA活性測定方法 μL

抑制率=(模型對照熒光數值-待測樣品熒光數值)/
(模型對照熒光數值-空白對照熒光數值)×100%

(1)

利用GraphPad Prism軟件擬合曲線，得到各個藥物的半數抑制濃度(IC50值)。

3 結果與分析

3.1 分子對接結果與分析

3.1.1 實驗條件準確性驗證 使用UCSF Chimera軟件將晶體結構中的原配體提取出來，再利用AutoDock Vina將原配體對接回處理好的受體蛋白結合位點中，對接后的配體分子與原配體分子的均方根偏差RMSD<2?，且對接后在活性口袋中與受體發生作用的氨基酸殘基能較好地和原配體的氨基酸殘基保持一致，那么證明該方法能較好地重復出原受體-配體結合的構象，具體結果見圖1。

圖1 對接后的配體分子與原配體分子構象疊合圖

3.1.2 化合物與NA的結合能 分子對接過程涉及配體與受體之間的空間匹配和能量匹配，空間匹配是分子間發生相互作用的基礎，能量匹配是分子間保持穩定結合的基礎，因此結合能是篩選活性分子的關鍵[11]。綜合23個化合物與18個受體的結合能，對接結果表明前5名的化合物與各類型的NA的結合能均較低(7.4～10.5 kcal·mol-1)，提示它們對各類型、亞型的NA均具有一定的抑制作用，同時可以發現化合物單體Z21與18個受體的結合能大多數低于其他4個化合物，結果見表4。

表4 排名前五的化合物與NA作用的結合能值 kcal·mol-1

3.1.3 化合物與NA的結合模式 有研究者根據神經氨酸酶蛋白各亞型晶體結構將其分為兩類，第一類有N1、N4、N5、N8；第二類有N2、N3、N6、N7、N9等，這兩類神經氨酸酶結構的不同之處主要體現在150-loop(147～152位氨基酸殘基)和150-cavity。在第一類的晶體結構中，150-loop呈開放狀態，這使其活性中心可以延伸到150-cavity；而在第二類的晶體結構中，150-loop是閉合的，故其活性中心與150-cavity不連續[12]。從這些化合物與NA活性口袋的結合模式看，紫萁貫眾中的黃酮類化合物可同時嵌入第一類NA(N1、N5、N8)的活性口袋和150-cavity內，而其他類化合物只能單獨地嵌入活性口袋中，以化合物與NA(3CKZ)結合模式為例展示(見圖2)，因此推測紫萁貫眾中黃酮類化合物抗NA活性高于其他類化合物。

3.1.4 化合物與活性口袋中氨基酸殘基的作用情況 配體-NA復合物的穩定性不僅依賴于配體分子與NA之間的氫鍵作用，還依賴于配體分子與NA之間的疏水作用[13]，與氨基酸殘基形成氫鍵和疏水作用基團越多，氫鍵距離越短，相互作用越緊密，對降低結合能貢獻越大，從而阻礙宿主體內受體蛋白與唾液酸的結合，對病毒產生抑制作用。根據與NA結合模式推測，對紫萁貫眾中黃酮類化合物與氨基酸殘基的作用情況進行分析，結果表明它們不僅能夠與ARG118、ARG371、ARG292等重要氨基酸殘基產生氫鍵作用，還與其他不同于傳統結合位點的氨基酸產生相互作用，以結合能得分最低的化合物Z21為例展示(見表5)。

圖2 紫萁貫眾中各類化合物與NA(3CKZ)的三維結合模式圖

綜合考慮化合物的結合能、與活性口袋的結合模式以及與氨基酸殘基的作用情況，篩選出Z21作為候選化合物，同時化合物Z17紫萁酮在紫萁貫眾中含量較高，為2015版《中華人民共和國藥典》中紫萁貫眾鑒別的對照品，故選擇Z17和Z21化合物進行活性驗證。20世紀爆發的4次世界大流感，其中2次是由于H1N1引起的，其具有易感染人體且致命性強的特點，因此選用H1N1的神經氨酸酶。

表5 紫萁貫眾中化合物Z21與NA的對接結果

續表5

3.2 候選化合物對流感病毒NA的活性

兩個候選化合物對NA均有不同程度的抑制作用(見表6)，其中Z21異銀杏雙黃酮對NA的抑制作用較為顯著，IC50值為 (42.54±2.85) μmol·L-1。

4 討論

NA是A、B型流感病毒的表面蛋白，其在流感病毒的感染和復制過程中發揮重要作用，且其活性位點高度保守，是抗流感藥物的重要靶點。本研究應用分子對接軟件研究紫萁貫眾中各類化合物抑制流感病毒NA的作用，從結合能結果看，紫萁貫眾中的黃酮類與NA的結合能較低，通過分析其與NA的結合模式，發現黃酮類化合物能夠同時嵌入NA的活性口袋和150-cavity；經過分析化合物與活性口袋中氨基酸殘基的作用情況，表明黃酮類化合物結構中的羰基、羥基和醚基能夠不同程度地與NA中的重要氨基酸殘基形成氫鍵和疏水作用，而不同于傳統結合位點的氨基酸殘基也能與之相互作用。綜合以上分析，從理論上證實了紫萁貫眾中的黃酮類化合物是與NA作用最有潛力的化合物，神經氨酸酶抑制活性驗證實驗的結果表明：候選化合物異銀杏雙黃酮對NA有較顯著的抑制作用，IC50值為(42.54±2.85)μmol·L-1。

表6 候選化合物對NA的抑制活性