基于網(wǎng)絡(luò)藥理學研究紅根草化學成分的分子機制△

胡俊輝，姚銀輝，王瑩，趙靜怡，姜艷平*

1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000；2.承德醫(yī)學院，河北 承德 067000

紅根草Salviaprionitis又稱作“草原老鸛草”，主要分布于廣東、廣西、江西、湖南、浙江等省，民間常用全草入藥用于治療急性扁桃體炎、肺炎、腸炎腹瀉、腹痛、痢疾，并且曾報道紅根草鄰醌對P388白血病有很強的抑制作用[1]。隨著對紅根草化學成分及藥理作用的深入研究，現(xiàn)已有黃酮類、二萜類、生物堿等多種成分報道[2-3]。但是對紅根草單體化合物的藥理作用和其相應(yīng)機制研究較少，限制了其化學成分藥物開發(fā)的利用。

中藥綜合數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID)收集中藥各方面的信息數(shù)據(jù)，包括方劑組成、草藥、中藥成分、藥物作用靶點和疾病等。TCMID提供全面中藥數(shù)據(jù)信息，不僅有利于促進中藥現(xiàn)代化研究，也便于開發(fā)潛在的新藥和揭示其作用機制[4-5]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，研究紅根草化學成分的分子機制，探討紅根草多成分、多靶點的藥物作用機制，進一步深入研究紅根草的藥用價值。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)挖掘

在中藥綜合數(shù)據(jù)庫(http：//www.megabio-net.org/tcmid/)中，以“HONG GEN CAO”為檢索詞，對紅根草的中藥化學成分進行收集，建立其化學成分、潛在作用靶點、疾病的分析數(shù)據(jù)集。并且對潛在作用靶點的基因名通過UniProtKB(http：//www.uniprot.org)進行提取，對象限定為人類(Homosapiens)。

1.2 功能富集分析和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

首先對紅根草化學成分的潛在作用靶點的基因輸入STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins，http：//sting-db.org)構(gòu)建相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)，對相互作用蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以分值(median confidence)>0.4的蛋白網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導入軟件Cytoscape 3.5.1進行可視化。關(guān)鍵基因的選擇采用該MCODS(Molecular Complex Detection)v1.4.2插件進行分析。功能富集分析采用插件BiNGO進行生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞組分(cellular component，CC)的可視化，設(shè)定P<0.05。

1.3 通路富集分析

在KOBAS 3.0(http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/index.php)中輸入紅根草化學成分的潛在作用靶點的Uniprot，對象限定為人類(Homosapiens)，進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，設(shè)定P<0.05選擇通路，采用Cytoscape 3.5.1構(gòu)建可視化紅根草-化學成分-潛在作用靶點-KEGG通路圖。

2 結(jié)果

2.1 紅根草化學成分

本次收集紅根草化學成分共18種(表1所示)。其中4種化學成分有對應(yīng)的潛在作用靶點(201個)和疾病(204種)，如圖1所示，4種化學成分有對應(yīng)的潛在作用靶點的異同，它們分別是3，4-dihydroxybenzoicacid(原兒茶酸)、4-hydroxysaprorthoquinone(4-羥基紅根草鄰醌)、dihydrotanshinone Ⅰ(二氫丹參酮Ⅰ)和tanshinone Ⅰ(丹參酮Ⅰ)。通過上述數(shù)據(jù)利用Cytoscape軟件構(gòu)建出紅根草-化學成分-潛在作用靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，其結(jié)果共410個節(jié)點、413條邊。紅根草化學成分丹參酮Ⅰ的靶向蛋白最多，并且多種疾病對應(yīng)同種靶向蛋白。

表1 紅根草18種化學成分

注：3，4-dihydroxybenzoicacid(原兒茶酸)、4-hydroxysaprorthoquinone(4-羥基紅根草鄰醌)、dihydrotanshinone Ⅰ(二氫丹參酮Ⅰ)和tanshinone Ⅰ(丹參酮Ⅰ)分別用粉色、草綠色、黃色和藍紫色表示。圖1 紅根草4種化學成分對應(yīng)的潛在作用靶點

2.2 紅根草化學成分潛在作用靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過STING構(gòu)建紅根草潛在作用靶點的相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，利用Cytoscape軟件獲得其網(wǎng)絡(luò)關(guān)系可視化。構(gòu)建相互作用蛋白的網(wǎng)絡(luò)分值(median confidence)，>0.4的蛋白才可納入，所以原201個蛋白去除了45個，從而得到156節(jié)點、536條邊的網(wǎng)絡(luò)相互作用圖。并采用該插件MCODSv1.4.2進行分析，獲得紅根草化學成分潛在作用靶點的關(guān)鍵基因網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，如圖2所示。

注：黃色為作用靶點。圖2 紅根草潛在作用靶點的相互作用中關(guān)鍵節(jié)點

2.3 紅根草化學成分潛在作用靶點的功能富集分析

通過Cytoscape軟件的插件BiNGO功能富集分析生物學過程(BP)、分子功能(MF)和細胞組分(CC)，如圖3所示，其中共697個節(jié)點、1096條邊，圖中P<0.05呈黃色顯示。其中BP包括metabolic process、proteolysis和regulation of biological quality等；MF包括scavenger receptor activity、catalytic activity和serine hydrolase activity等；CC包括extracellular region、extracellular region part和extracellular space等。

圖3 紅根草潛在作用靶點功能富集分析

2.4 KEGG通路富集分析

通過KOBAS 3.0分析得到KEGG通路共196個，其中P<0.05的通路111個，包括作用蛋白共109個，紅根草化學成分的相關(guān)通路信息按照P值由小到大排序列出前10個(見表2)。通過上述獲得的18個關(guān)鍵基因在KOBAS 3.0分析得到KEGG通路共107個，其中P<0.05的通路87個，按照P值由小到大排序列出前10個(見表3)。其中兩次KEGG分析中共同有的67個通路，其中排前10個共同有的通路有7個，而關(guān)鍵基因只有12個存在于信號通路中，具體可見表2和表3。將上述通路信息與紅根草、化學成分和潛在作用靶點結(jié)合，采用Cytoscape 3.5.1構(gòu)建可視化紅根草-化學成分-潛在作用靶點-KEGG通路的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(見圖4)和紅根草-化學成分-關(guān)鍵靶點-KEGG通路的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系(見圖5)。

表2 紅根草化學成分的相關(guān)通路信息(前10個通路)

表3 紅根草關(guān)鍵基因的相關(guān)通路信息(前10個通路)

注：綠色為中藥，藍色為化學成分，黃色為作用靶點，紅色為KEGG通路。圖4 紅根草-化學成分-潛在作用靶點-KEGG通路的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

注：綠色為中藥，藍色為化學成分，黃色為作用靶點，紅色為KEGG通路。圖5 紅根草-化學成分-關(guān)鍵靶點-KEGG通路的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學作為一種有助于提高發(fā)現(xiàn)藥物作用機制的方法，在心血管藥理[6]、腫瘤藥理[7]和抗病毒感染[8]等多方面都有應(yīng)用。本研究通過TCMID挖掘紅根草的化學成分、潛在作用靶點和疾病，結(jié)合STING、KOBAS和Cytoscape分析蛋白相互作用、KEGG通路和GO功能富集分析，獲得4種化學成分，201個潛在作用靶點，204種疾病，67個信號通路，體現(xiàn)了紅根草作為中藥具有多成分、多靶點、協(xié)同作用的特點。通過關(guān)鍵基因的KEGG通路分析，進一步說明紅根草化學成分和腫瘤的有關(guān)通路密切相關(guān)。

KEGG通路富集分析中與感染相關(guān)的通路包括Staphylococcusaureusinfection、Epithelial cell signaling inHelicobacterpyloriinfection和HTLV-I infection。這與早先報道紅根草黃酮類具有體外抑菌的作用結(jié)果一致[9]。因此關(guān)于紅根草對腸炎腹瀉、腹痛和痢疾的療效研究可與上述的通路聯(lián)系，進一步為臨床治療提供理論依據(jù)。

曾有研究報紅根草鄰醌對P388白血病有很強的抑制作用[1]，但是對于其作用機制了解甚少。本研究中KEGG通路富集分析中包括Chronic myeloid leukemia，這就為紅根草研究白血病提供研究理論基礎(chǔ)，便于后續(xù)實驗對此機制加以證明。同時KEGG通路富集分析中包括多條和腫瘤相關(guān)的通路，如Transcriptional misregulation in cancer、Colorectal cancer、Pathways in cancer、Bladder cancer和MicroRNAs in cancer等通路。在1995年，我國學者就報道了對紅根草鄰醌結(jié)構(gòu)修飾得到新化合物(沙爾威辛)，表現(xiàn)具有很強的抗腫瘤活性。其藥理實驗證實沙爾威辛不僅可以抑制癌細胞的生長，還可阻斷癌細胞修復再生，與同類藥物相比，具有不良反應(yīng)小、抗耐藥、抗轉(zhuǎn)移的特性[2]。因此為研究紅根草抗腫瘤活性提供理論依據(jù)，豐富其抗腫瘤方面的藥用價值。

4 結(jié)論

本研究對于紅根草化學成分的網(wǎng)絡(luò)藥理學只限于4種化學成分，其中以丹參酮Ⅰ為主。隨著紅根草化學成分研究的深入，不僅僅局限于18種已知成分，越來越多的有關(guān)成分研究將隨之報道。對于紅根草化學成分的藥理作用機制研究亦加快進度，才可極大擴展對其相關(guān)機制的認識和了解，為紅根草藥用植物資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。