黃連素對(duì)冠心病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究

冠心病(coronary heart disease，CHD)是嚴(yán)重危害人類健康的疾病，近年來，CHD 的發(fā)病趨勢(shì)逐年上升，且發(fā)病率趨于年輕化[1]。CHD最直接的影響就是心肌缺血從而導(dǎo)致心臟的供氧減少，不能支持心臟正常工作，甚至導(dǎo)致部分心肌細(xì)胞凋亡[2-3]。黃連素(berberine，BBR)是從黃連、黃柏等植物中提取的生物堿，具有一定的抗菌和降血脂作用[4]。研究報(bào)道，黃連素可能通過促進(jìn)抗氧化核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2表達(dá)，對(duì)H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后的凋亡具有顯著的抑制作用[5]。黃連素可抑制ERK1/2途徑，減輕大氣細(xì)顆粒物對(duì)EA.hy926內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)的損傷凋亡[6]。提示黃連素對(duì)包括心肌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞凋亡具有抑制作用。但黃連素在抑制心肌細(xì)胞凋亡中的機(jī)制還不完善。因此，本研究通過建立冠心病大鼠模型，觀察黃連素對(duì)模型動(dòng)物心肌凋亡的作用，探討其在上述作用中的信號(hào)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠50只，體重(200±20)g，常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：No.201722172。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 黃連素(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，腦垂體后葉素(南京新百藥業(yè)有限公司)，Caspase 3、Bcl-2、Bax、Calpain1、Calpastatin抗體及羊抗兔和羊抗鼠IgG-HRP 二抗(美國(guó)CST公司)，GAPDH 抗體(Bioworld公司)，RIPA裂解液、BCA試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；PrimeScriptTM RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ熒光定量試劑盒及引物(大連TaKaRa公司)。

1.3 主要儀器 PIPETMANL微量可調(diào)加樣器(法國(guó)Gilson公司)；Allegra 64R Centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；CKX41倒置顯微鏡(日本Olympus公司產(chǎn)品)；MiniVE電泳設(shè)備(美國(guó)GE公司產(chǎn)品)；ABI Prism?7300型熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司產(chǎn)品)。

1.4 動(dòng)物模型的建立及給藥 參考文獻(xiàn)[7]方法建立冠心病大鼠模型，每天給予高脂食物連續(xù)喂養(yǎng)6周；間隔 24 h腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，連續(xù) 3 次。將模型動(dòng)物分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組30只，對(duì)照組10只。實(shí)驗(yàn)組予以高[100 mg/(kg·d)]、中[50 mg/(kg·d)]、低[25 mg/(kg·d)]劑量黃連素灌胃，每劑量組10只大鼠；對(duì)照組每天予以等黃連素體積的雙蒸水灌胃。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)以正常SD大鼠10只設(shè)立空白組，予以等黃連素體積的雙蒸水灌胃，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物治療周期為12周。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和硝酸酶還原法檢測(cè)血清炎癥因子含量 參考文獻(xiàn)[8]并根據(jù)說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，檢測(cè)大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β (IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量變化。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量(RT-qPCR)檢測(cè)心肌細(xì)胞中Calpain1和Calpain2 mRNA水平變化 收集各組大鼠的心肌組織，部分進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。按文獻(xiàn)[9]方法進(jìn)行RNA提取和純化、RT反應(yīng)、qPCR反應(yīng)，并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.7 蛋白印記實(shí)驗(yàn)分析各組大鼠相對(duì)蛋白表達(dá)量 收集各組模型大鼠的心肌組織。參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行蛋白提取、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜，及封閉。按需求加入Caspase 3抗體(1∶1 000)、Bcl-2抗體(1∶2 000)、Bax抗體(1∶2 000)、Calpain1抗體(1∶1 000)、Clapastatin抗體(1∶1 000)及DAPDH(內(nèi)參)抗體，4 ℃溫育過夜。次日，TBST洗膜3次，再加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫雜交1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，用Syngene Imaging System進(jìn)行成像，用Image J對(duì)蛋白印跡條帶進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較 與空白組相比，對(duì)照組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著上升(P<0.05)；與對(duì)照組相比，高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組TNF-α、IL-1β、IL-6含量均有不同程度下降(P<0.05)。詳見表1。

2.2 各組大鼠心肌Calpain1和Calpain2 mRNA水平比較 與空白組相比，對(duì)照組Calpain1 mRNA相對(duì)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Calpain2 mRNA無明顯變化；與對(duì)照組相比，高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組Calpain1 mRNA相對(duì)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；而Calpain2無明顯變化。詳見圖1。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較(±s) ng/L

1) 與空白組比較，P<0.05；2) 與對(duì)照組比較，P<0.05

※對(duì)照組與空白組比較，P<0.01；與對(duì)照組比較，#P<0.05，△ P<0.01圖1 各組大鼠心肌Calpain1和Calpain2相對(duì)mRNA表達(dá)水平比較

2.3 各組大鼠心肌Calpain1及Calpastatin相對(duì)蛋白表達(dá)水平 與空白組相比，對(duì)照組大鼠心肌組織Calpain1蛋白表達(dá)量增多(P<0.01)，而Calpastatin蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.01)；與對(duì)照組相比，高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌組織Calpastatin蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05或P<0.01)，而Calpain1蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)，并呈劑量依賴性。詳見圖2、表2。

a為空白組；b為對(duì)照組；c為高劑量組(實(shí)驗(yàn)組)；d為低劑量組(實(shí)驗(yàn)組)；e為中劑量組(實(shí)驗(yàn)組)圖2 蛋白印跡檢測(cè)各組大鼠心肌Calpain1和Calpastatin相對(duì)蛋白表達(dá)水平

表2 各組大鼠心肌組織Calpain1和Calpastatin相對(duì)蛋白表達(dá)水平比較(±s) %

1) 與空白組比較，P<0.01；與對(duì)照組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.4 各組大鼠心肌Cleaved-Caspase 3、Bcl-2、Bax相對(duì)蛋白表達(dá)水平比較 與空白組相比，對(duì)照組大鼠心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，而Bax和Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌Bcl-2蛋白表達(dá)增多，Bax和Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)明顯下降，并呈劑量依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。詳見圖3、表3。

a為空白組；b為對(duì)照組；c為高劑量組(實(shí)驗(yàn)組)；d為低劑量組(實(shí)驗(yàn)組)；e為中劑量組(實(shí)驗(yàn)組)圖3 蛋白印記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠心肌Bcl-2、Bax和Cleaved-Caspase 3相對(duì)蛋白表達(dá)水平

表3 各組大鼠心肌Bcl-2、Bax及Cleaved-Caspase 3相對(duì)蛋白表達(dá)水平比較(±s) %

1) 與空白組比較，P<0.01；與對(duì)照組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

3 討 論

CHD為冠狀動(dòng)脈血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變而引起血管腔狹窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧的疾病。臨床研究表明，CHD病人血清促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6升高[11]。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6顯著上升，這與臨床研究相一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，3種劑量黃連素治療12周后，模型大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6均降低，提示黃連素可減緩模型大鼠炎癥反應(yīng)。在正常情況下，心肌在缺血缺氧時(shí)即可發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常大鼠比較，模型大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)量降低，而Bax和Cleaved-Caspase 3表達(dá)升高，提示模型大鼠心肌細(xì)胞發(fā)生一定程度的凋亡；黃連素治療后模型大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)量升高，而Bax和Cleaved-Caspase 3表達(dá)量降低，提示黃連素對(duì)CHD大鼠心肌凋亡有抑制作用。

凋亡擁有復(fù)雜的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制，但黃連素與凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制還未完全明確。Calpain屬于Ca2+依賴性半胱氨酸蛋白酶水解家族。研究表明，廣泛表達(dá)的Calpain可分為Calpain1和Calpain2，二者活性受到其天然的活性抑制分子Calpastatin的抑制[13]。研究報(bào)道，Calpain在線粒體途徑、死亡受體途徑乃至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑中都發(fā)現(xiàn)其促凋亡作用[13]。為觀察Calpain是否參與黃連素對(duì)心肌凋亡的影響，本研究檢測(cè)了心肌Calpain1和Calpain2 mRNA表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)模型大鼠心肌Calpain1 mRNA顯著升高，而黃連素治療后Calpain1 mRNA下降，在蛋白水平上也觀察到了類似的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，Calpastatin蛋白表達(dá)與Calpain1呈相反趨勢(shì)，Calpastatin為Calpain的天然活性抑制分子。提示在模型大鼠心肌中Calpain1活性升高，黃連素治療后Calpain1活性降低。有文獻(xiàn)報(bào)道，在缺血缺氧腦損傷新生大鼠心肌中Calpain1剪切體增多，活性升高，且與細(xì)胞凋亡有關(guān)[14]。提示黃連素可能通過降低Calpain1活性抑制心肌細(xì)胞凋亡。有研究表明，Calpain可剪切凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-7及促凋亡蛋白Bax和Bid[13]。而本研究未觀察黃連素是否參與上述凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此還有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，黃連素能降低CHD大鼠心肌細(xì)胞凋亡，該作用可能與增強(qiáng)Calpain1蛋白表達(dá)和活性，下調(diào)血清中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量有關(guān)。