GLP-1對3T3-L1前脂肪細胞增殖及脂聯素的影響

邢 英，梅彩霞2，瑪依拉·卡哈爾，李雅麗

肥胖是一種多因素引起的慢性代謝性疾病，表現為體內脂肪堆積過多，體重增加[1]。隨著人們生活水平的提高和生活方式的改善，肥胖發病率呈逐年上升趨勢。據世界衛生組織統計，全球約有3 億人患有肥胖，占全球人口7%以上[2]。中國成人超重率為22.8%，肥胖率為7.1%[3]。肥胖是許多慢性疾病如糖尿病、高血壓、高脂血癥、動脈硬化等的主要危險因素，已經成為威脅人類健康的殺手之一[4-5]。脂肪組織是人體重要的儲能組織，脂肪細胞出現增殖和分化的異常，將會引發脂肪肝、代謝綜合征和心血管疾病等。因此，干預脂肪細胞增殖和分化成為防治上述疾病的關鍵[6]。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide 1，GLP-1)及其相關藥物，因具有改善胰島素抵抗、降低體重、改善脂代謝等作用，越來越多地被應用于肥胖等相關疾病的治療中[7]。有研究發現，GLP-1可能通過上調血清脂聯素水平，改善糖脂代謝，進而使機體胰島素敏感性增加[8-9]。本研究運用GLP-1干預 3T3-L1前脂肪細胞，觀察其對脂肪細胞增殖以及脂聯素的影響，為闡明GLP-1對肥胖過程影響提供前期研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 3T3-L1小鼠前脂肪細胞系(ATCC品牌)，GLP-1、胰島素(INSULIN)、地塞米松(DEX)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)購自美國Sigma公司，高糖培養基(DMEM，Hyclon 公司)，10%胎牛血清(FBS，Hyclon公司)，二甲基亞砜(DMSO)購自中杉金橋公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及誘導分化 將3T3-L1前脂肪細胞系加入含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，在37 ℃、5%CO2條件下培養，待細胞達到完全融合，48 h后開始誘導，換誘導劑Ⅰ：98.74 mL(90%DMEM+10%FBS)，1 mL IBMX(終濃度0.5 mmol/L)，161 μL INSULIN(850 nmol/L)，100 μL Dex(1 μmol/L)。3 d后換誘導劑Ⅱ：99.84 mL(90%DMEM+10%FBS)，161 μL胰島素(850 nmol/L)，繼續培養，每2 d換液1次，至第8天，約90%的細胞呈脂肪細胞表型時行下一步處理。

1.2.2 試驗分組及處理 將誘導成功的3T3-L1前脂肪細胞以濃度0 nmol/L、1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L的GLP-1作用于3T3-L1前脂肪細胞，共同培養至第8天，在培養第2天、第4天、第6天、第8天收集細胞備用，每組均設3個復孔。

1.2.3 細胞計數試劑盒(CCK-8)比色法測定GLP-l對細胞增殖的影響 3T3-L1前脂肪細胞以1×104/mL，每孔100 N，4復孔接種于96孔培養板，在37.5% CO2培養箱中培養12 h后，觀察見細胞已貼壁。設對照組(0 nmol/L)和干預組(分別加入終濃度1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L、1 000 nmol/L的GLP-1)，細胞共培養8 d，每24 h更換含藥培養液1次。第2天、第4天、第6天、第8天經CCK-8比色法應用酶聯免疫檢測儀測定吸光度(OD)值以代表活細胞數及細胞增殖情況。實驗重復3次。

1.2.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測定3T3-L1前脂肪細胞培養基中脂聯素含量 在上述實驗步驟基礎上，第2天、第4天、第6天、第8天經ELISA法測定細胞上清液中脂聯素含量。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 小鼠3T3-L1前脂肪細胞形態學表現 倒置顯微鏡下觀察：誘導分化前，3T3-L1細胞呈梭形，胞漿內無脂滴，表現為纖維母樣的前脂肪細胞形態(圈)。誘導分化4 d后細胞變大、變圓，部分細胞中出現分散的細小脂滴；誘導8 d后，80%左右細胞均分化為成熟脂肪細胞，表現為細胞進一步增大，呈圓形，胞漿內含有大量脂滴，脂滴聚集于核周，形成“戒環”樣形態。結果見圖1～圖3。

圖1 誘導第0天3T3-L1前脂肪細胞形態(×20)

圖2 誘導第4天3T3-L1前脂肪細胞形態(×20)

圖3 誘導第8天3T3-L1前脂肪細胞形態(×20)

2.2 不同濃度GLP-1作用不同時間對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響 應用不同濃度GLP-1干預3T3-L1前脂肪細胞的增殖過程，干預第4天，100nmol/L、1 000 nmol/L較0 nmol/L細胞數量降低(P<0.05)；第6天，100 nmol/L、1 000 nmol/L較0 nmol/L細胞數量降低(P<0.05)；第8天，隨著GLP-1干預濃度的增長，細胞數量較0 nmol/L明顯降低(P<0.05或P<0.01)。以上結果顯示，高濃度長時間GLP-1干預對3T3-L1前脂肪細胞增殖的抑制作用更明顯。詳見表1。

表1 不同濃度GLP-1對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響(OD值)(±s)

與同時間0 nmol/L比較，1)P<0.05，2)P<0.01

2.3 不同濃度GLP-1作用不同時間對3T3-L1前脂肪細胞培養基中脂聯素含量的影響 隨著GLP-1濃度的逐漸增高，3T3-L1前脂肪細胞培養液中脂聯素含量逐漸升高，呈一定的濃度依賴性(P<0.05或P<0.01)。在相同濃度GLP-1干預下，隨著作用時間的延長，脂聯素的含量也逐漸升高。詳見表2。

表2 不同濃度GLP-1對3T3-L1前脂肪細胞培養基中脂聯素含量的影響(±s) mg/L

與同時間0 nmol/L比較，1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

近年來，脂肪細胞分化調控及其與肥胖、胰島素抵抗的關系一直是國內外的研究熱點。脂肪組織是一個新型的內分泌組織，其分泌的許多脂肪細胞因子對維持體內代謝平衡有著重要作用。3T3-L前脂肪細胞功能與之相似，廣泛應用于脂肪細胞增殖、分化和分化過程中基因表達調控的研究領域，也是研究減肥降脂降糖藥物及其作用機制的一個方向[10]。GLP-1是一種腸促胰島素，和胰島細胞分泌的胰高血糖素一樣源于胰高血糖素原基因，在外周主要以肽的有效形式通過多種途徑發揮抗肥胖和其他代謝性疾病的作用[11]。

本研究以3T3-L1前體脂肪細胞為研究對象，探討GLP-1對其增殖的影響。本研究結果發現，GLP-1對3T3-L1前脂肪細胞增殖的影響隨不同濃度、不同作用時間有所不同。主要趨勢為隨著干預時間的延長，其對3T3-L1 前脂肪細胞的增殖有明顯抑制作用，且有劑量依賴關系。本研究中GLP-1濃度為1 000 nmol/L干預第8天時對3T3-L1 前體脂肪細胞的增殖抑制作用最強。

脂聯素是一種由244個氨基酸組成的蛋白質[12]，是一種幾乎全部由脂肪細胞分泌的脂肪因子，也是唯一一個分泌量與脂肪細胞體積呈反比的脂肪因子，具有改善外周和肝臟胰島素抵抗的作用。因此，本研究進一步探討不同濃度GLP-1作用時間對3T3-L1前脂肪細胞培養基中脂聯素含量的影響。結果顯示，GLP-1可升高培養基中脂聯素的含量，其趨勢表現為隨著GLP-1濃度的逐漸增高，3T3-L1前脂肪細胞培養液中脂聯素含量逐漸升高，呈一定的濃度依賴性且在相同濃度GLP-1干預下，隨著作用時間的延長，脂聯素的含量也逐漸升高。這些結果初步表明，GLP-1可明顯增加3T3-L1前脂肪細胞脂聯素的含量，可能是其抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖的機制之一。以往的研究表明脂聯素通過與AdipoR1和AdipoR2結合后，分別激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和過氧化酶體增殖物激活受體α(PPARα)途徑減少脂肪酸合成，從而減少脂肪的儲存而發揮作用[13-14]。因此，GLP-1抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖的分子機制有待于進一步研究。

綜上所述， GLP-1可抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖并升高脂聯素含量，為臨床使用GLP-1干預肥胖癥提供了可能，但其作用機制仍有待于進一步深入研究。