純氧和空氣肺通氣下基因差異表達與肺損傷的關(guān)系

陳 超 李云濤 張紅波 沈 亮 聶小虎 韋鵬翔

1.湖州市中心醫(yī)院 湖州師范學(xué)院附屬中心醫(yī)院麻醉科，浙江湖州 313000；2.湖州市中心醫(yī)院 湖州師范學(xué)院附屬中心醫(yī)院神經(jīng)外科，浙江湖州 313000；3.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科，廣東廣州 510000；4.南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇常州 213000；5.廣西壯族自治區(qū)北海市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，廣西北海 536000

肺通氣是肺與外界環(huán)境之間的氣體交換過程，是肺復(fù)蘇、急性呼吸窘迫綜合征、全麻手術(shù)等維持血氧含量的常用方法。低潮期量、單肺通氣、呼氣末正壓通氣等不同的肺通氣形式可影響通氣后肺損傷程度［1-4］。高氧濃度肺通氣也是導(dǎo)致肺損傷的重要危險因素［5］，而目前對高氧濃度肺通氣的氧化應(yīng)激損傷的機制知之甚少。氧化應(yīng)激損傷可以通過產(chǎn)生活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）引起細胞結(jié)構(gòu)的破壞和功能的受損。氧化應(yīng)激是導(dǎo)致肺損傷的重要危險因素［6-8］，是肺通氣損傷的重要機制之一，而控制氧化應(yīng)激損傷可以保護肺組織［9］。肺組織氧化應(yīng)激損傷程度又與氧濃度相關(guān)［10-11］，高濃度的氧氣進入機體后，脂質(zhì)的過氧化、氧自由基的產(chǎn)生可以損傷肺組織線粒體，破壞膜結(jié)構(gòu)和損傷細胞功能。因此，氧化應(yīng)激損傷在肺通氣損傷過程中具有重要的研究價值，進一步研究不同氧濃度對肺通氣過程中肺損傷的影響及其可能的機制，可能為未來肺通氣模式的選擇提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

本研究的芯片數(shù)據(jù)（GSE489）均來源于GEO 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/），包含5 只大鼠（褐家鼠）的數(shù)據(jù)，以空氣（氧含量21%）通氣為對照組（n=2），純氧（氧含量100%）通氣為實驗組（n=3）。

1.2 差異基因篩選

采用R（3.5.1 版）軟件調(diào)用“l(fā)imma”包分析兩組存在差異表達的基因，設(shè)置基因表達差異倍數(shù)的絕對值＞2，P ＜0.05 即定義為差異基因。

1.3 基因功能富集分析

差異基因?qū)隓AVID（6.8 版）進行基因注釋及功能富集分析，主要采用GO 功能富集分析中生物學(xué)過程（biological process，BP）、細胞成分（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3 種類別的分析，選擇錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR） ＜0.05 的功能富集并進一步分析可能與肺損傷有關(guān)的基因。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及數(shù)據(jù)可視化

采用在線工具STRING（11.0 版）對差異基因進行多蛋白關(guān)聯(lián)分析，從已知相互作用、預(yù)測相互作用和文本挖掘等3 個方面構(gòu)建蛋白間網(wǎng)絡(luò)，最低互作評分值選擇中度可信（0.400）。對功能富集分析結(jié)果的adj.pval取對數(shù)，繪制柱狀圖；根據(jù)富集分析數(shù)據(jù)匹配基因表達量繪制圓圈圖、和弦圖。

2 結(jié)果

2.1 差異基因分析結(jié)果

共得到差異基因140 個，其中上調(diào)基因56 個，下調(diào)基因共84 個。見圖1。

圖1 兩組差異基因熱圖

2.2 差異基因功能富集及可視化

差異基因共獲得FDR ＜0.05 的功能富集6 項，見圖2，功能富集中與肺損傷可能相關(guān)的包括線粒體、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、同源二聚蛋白激活，富集分析結(jié)果中以低表達基因出現(xiàn)多見，該現(xiàn)象在線粒體、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ中最突出，其中線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ均為低表達基因（圖3），分別是NDUFB3、NDU FA4、NDUFB1、NDUFB9、NDUFB10、NDUFC1、NDUFC2基因。

和弦圖中共有52 個基因參與線粒體、線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ、同源二聚蛋白激活3 項功能，其中與線粒體有關(guān)的基因有35 個，與同源二聚蛋白激活有關(guān)的基因20 個，與線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ有關(guān)基因有7 個。見圖4。

圖2 GO 分析柱狀圖

圖3 各項功能富集結(jié)果中上、下調(diào)基因的分布情況

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

差異基因在STRING 中存在蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并形成不同的基因功能簇，見圖5A，其中藍色部分基因簇網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，關(guān)鍵基因有NDUFA4、NDUFB3、NDUFB9、NDUFB10、NDUFC1、NDUFC2、CYC1 等，見圖5B，與和弦圖中線粒體呼吸鏈復(fù)合體I 的基因簇高度相似。

圖4 和弦圖中各個基因參與的功能富集分布

圖5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖

3 討論

肺內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的來源不僅僅是外源性，也可以是內(nèi)源性，研究發(fā)現(xiàn)［10-11］，不同的氧濃度是影響肺損傷的重要因素。純氧肺通氣有擴張萎陷不張的肺組織、改善氧合、減少肺泡剪切力等優(yōu)點，但是大量氧氣瞬間涌入會造成氧自由基的大量釋放，激活嚴重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成肺組織的氧化應(yīng)激損傷［12］。為進一步研究氧化應(yīng)激肺損傷的機制，本研究通過生物信息的分析手段比較純氧和空氣通氣兩種條件下基因差異表達，并發(fā)現(xiàn)線粒體及線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ是肺損傷發(fā)生的重要部位。

在線粒體內(nèi)發(fā)生遞電子反應(yīng)的4 個呼吸鏈復(fù)合體（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）中，復(fù)合體Ⅰ蛋白結(jié)構(gòu)最復(fù)雜，是ATP 來源最多的復(fù)合體［13-14］，但也是產(chǎn)生ROS 的主要部位，線粒體中遞電子傳遞系統(tǒng)通過NADH-泛醌氧化還原酶的作用轉(zhuǎn)變?yōu)镽OS 和自由基，ROS 和自由基使生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化，破壞膜的正常結(jié)構(gòu)，改變膜的通透性、流動性，從而影響膜的生物學(xué)功能［15］。復(fù)合體Ⅰ不僅是形成自由基的部位，也是對自由基損害特敏感的部位。ROS 和自由基是通過抑制線粒體電子傳遞鏈中復(fù)合體Ⅰ的活性發(fā)揮毒性作用，當(dāng)其活性被抑制后會導(dǎo)致膜的脂質(zhì)發(fā)生過氧化損傷，最終導(dǎo)致細胞ATP 獲取障礙而死亡［16］。呼吸鏈中80%的復(fù)合體Ⅰ都是以超級復(fù)合體（例如復(fù)合體Ⅰ/Ⅲ）形式存在，因此復(fù)合體Ⅰ是呼吸鏈中超級復(fù)合體的必要組成部分［17］。

本研究結(jié)果顯示，純氧通氣后線粒體復(fù)合體Ⅰ中的7 個差異基因（NDUFA4、NDUFB1、NDUFB3、NDUFB9、NDUFB10、NDUFC1、NDUFC2）均出現(xiàn)低表達現(xiàn)象，而這些基因與介導(dǎo)激活氧化調(diào)控［18］、清理氧化代謝產(chǎn)物［19］、維持正常的線粒體功能［20］等生物學(xué)過程相關(guān)。此外，STRING 分析工具從蛋白水平進行了外部驗證，結(jié)果獲得了與和弦圖高度類似的基因聚集現(xiàn)象。純氧通氣后，氧自由基和ROS 這些具有細胞毒性的自由基抑制了肺組織內(nèi)線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的活性，使具有傳遞電子功能的7 個基因出現(xiàn)表達水平下降，從而使線粒體的結(jié)構(gòu)發(fā)生損害，組織細胞因供能障礙而死亡。除了潮氣量可以影響食管癌患者肺損傷程度外［21］，有學(xué)者報道不同氧濃度通氣對食管癌患者肺損傷影響存在差異，而具體機制尚不明確［22］。肺保護的機制研究需要關(guān)注分子水平［23-25］，本研究從基因水平提出純氧通氣可能是導(dǎo)致肺損傷的機制，可以進一步探索不同氧濃度通氣與肺損傷的關(guān)系。

總之，高氧含量通氣下的肺損傷主要是抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ的電子傳遞，電子漏出后影響線粒體ATP 的合成。NDUFA4、NDUFB1、NDUFB3、NDUFB9、NDUFB10、NDUFC1、NDUFC2 基因是氧化應(yīng)激損傷的主要差異基因，在肺損傷過程中發(fā)揮了重要的功能，但本研究基于生物信息分析結(jié)果，需進一步的實驗驗證。