BMSC-CM通過抑制Notch1信號通路促進神經(jīng)干細胞的有效分化

童 祎，宋旆文，申才良，劉曉穎

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種災(zāi)難性的、代價高昂的損傷，目前尚無有效的治療方法[1]。細胞移植可能是治療SCI的一種方法，神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)具有自我更新和分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞的能力[2]。然而，當神經(jīng)干細胞移植到受損的脊髓中時，這些細胞傾向于分化為星形膠質(zhì)細胞[3]。根據(jù)最近的體外研究[4-5]顯示骨髓間充質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)液(bone mesenchymal stem cell -conditioned medium，BMSC-CM)可以調(diào)節(jié)NSCs的分化過程。然而，BMSC-CM影響NSCs分化的分子機制尚待深入研究。Notch信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用[6]，Notch1被認為是調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要信號分子，增加神經(jīng)干細胞中Hes1、Hes5的表達可以抑制神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元類細胞分化[7]，促進神經(jīng)干細胞向膠質(zhì)細胞分化[8-9]?，F(xiàn)著重研究Notch1-Hes1/5信號通路與BMSC-CM影響NSCs分化方面是否有關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 生24～48 h齡SD大鼠1只和80～100 g成年雄性SD大鼠1只，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物科學(xué)研究所。

1.1.2主要試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；DMEM低糖培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Hyclone公司)；B-27(美國Invitrogen公司);表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)及堿性成纖維生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)(美國Pepro Tech公司);100 U/ml青霉素/0.1 mg/L鏈霉素(德國PAN公司)；小鼠抗大鼠巢蛋白(Nestin)抗體(美國Sigma公司)；小鼠抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體、兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白-2(microtubule associated protein-2，MAP-2)抗體(英國Abcam公司)；CY3標記的山羊抗兔IgG、AlexaFlour-488標記的山羊抗小鼠IgG(武漢伊萊瑞特生物有限公司)；Triton X-100(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAPI染色液、免疫熒光一抗稀釋液、免疫熒光二抗稀釋液(上海碧云天公司)；左旋氏多聚賴氨酸(美國Sigma公司);胰蛋白酶(美國Gibco公司)；Jagged-Fc融合蛋白(美國R&D System公司)；ECL蛋白顯影液試劑盒、BCA蛋白定量檢測試劑盒(美國Pierce公司)。

1.2 方法

1.2.1NSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定 取新生24～48 h齡SD大鼠，脫臼法處死，在75%酒精中浸泡5 min，斷頭，取出大腦，分離腦膜剝除血管后剪碎腦組織至1 mm3大小，加入0.25%胰蛋白酶消化10 min，輕柔吹打混勻，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾成單細胞懸液，然后以1 000 r/min離心5 min，棄除上清液，重懸沉淀，再以1 000 r/min離心5 min并棄除上清液，然后以3×105個/ml的密度將細胞接種于無血清的培養(yǎng)基上(DMEM/F12+2% B27+20 ng/ml bFGF+20 ng/ml EGF)并添加100 U/ml青霉素/0.1 mg/L鏈霉素，置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d加入新鮮的培養(yǎng)基，1周后神經(jīng)球直徑達到約100 μm，進行傳代。得到第2代神經(jīng)球，接種于經(jīng)0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被的蓋玻片，行免疫細胞化學(xué)熒光檢測神經(jīng)干細胞特異性蛋白(Nestin)，證實所培養(yǎng)的細胞為大鼠神經(jīng)干細胞。

1.2.2分離、培養(yǎng)BMSCs并制備BMSC條件培養(yǎng)液 參考本課題組前期的實驗方法[4]，取成年雄性SD大鼠1只(體質(zhì)量80～100 g)，從大鼠股骨和脛骨骨髓中分離培養(yǎng)BMSCs，將細胞以106個/ml的密度接種于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育。48 h后更換培養(yǎng)基，以后每3 d更換1次，丟棄未貼壁細胞。當貼壁細胞在新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細胞融合率達到90%時，用0.25 %胰蛋白酶消化，重新懸浮后，以1 ∶2的比例傳代。得到第3代生長良好的BMSCs，當貼壁率達90%時使用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)鑒定，見圖1。將原培養(yǎng)液換成不含胎牛血清的DMEM/F12再培養(yǎng)24 h，倒出培養(yǎng)液，最后用直徑0.22 μm的孔濾器過濾獲得所需條件培養(yǎng)基。

圖1 第3代骨髓間充質(zhì)干細胞的成纖維細胞形態(tài) ×200

1.2.3NSCs的分組及分化培養(yǎng) 將生長良好的第2代NSCs接種在有0.1 mg/ml多聚賴氨酸包被處理蓋玻片的6孔板中培養(yǎng)，每孔細胞數(shù)約2×104個，先用DMEM/F12 +B27培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后根據(jù)實驗設(shè)計將NSCs分為四組，分別為：①對照組(NSCs)、 Jagged組(NSCs+1 μg/ml Jagged)、BMSC-CM組(NSCs+BMSC-CM)、 BMSC-CM+Jagged組(NSCs+BMSC-CM+1 μg/ml Jagged)。置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液1次。1周后對分組培養(yǎng)的細胞行免疫熒光染色實驗。

1.2.4NSCs的免疫熒光染色 實驗應(yīng)用免疫熒光染色技術(shù)檢對檢測細胞的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的特異性標志物MAP-2及GFAP。取出樣本，用0.01 mol/L的PBS洗3次，每次5 min，常溫下用4%多聚甲醛固定15～20 min，吸去多余殘液，再用PBS洗3次，每次5 min。含0.1% Triton X-100的PBS孵育20 min后，用PBS洗3次，每次5 min。加入正常山羊血清工作液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，然后加入1 ∶500稀釋的MAP-2一抗，1 ∶1 000稀釋的GFAP一抗，在4 ℃冰箱內(nèi)孵育過夜。第2天，取出標本，常溫下放置1 h后PBS洗3次，每次5 min。分別加入1 ∶200稀釋的特異性二抗CY3及Alexa Flour-488，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。取出標本，PBS洗3次，每次5 min。最后，室溫下用DAPI孵育10 min對細胞核染色。將載玻片用PBS漂洗3次，封片，熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.5Western blot分析 分別提取各組NSCs分化后細胞總蛋白，用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定各組蛋白含量，根據(jù)蛋白濃度選擇上樣量，依此行SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，非特異性封閉。加入一抗，所用抗體及稀釋度:抗MAP-2(1 ∶200稀釋)，抗GFAP(1 ∶500稀釋)，β-actin(1 ∶1 000稀釋)，抗Notch1(1 ∶200稀釋)，抗Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(notch intracellular domain,NICD)(1 ∶1 000稀釋)抗hes1(hairy and enhancer of split1)(1 ∶200稀釋)，抗Hes5(hairy and enhancer of split5)(1 ∶200稀釋)。于4 ℃冰箱孵育過夜，第2天用TBST洗膜4次，再加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，用TBST洗膜4次，用ECL化學(xué)發(fā)光顯影并行膠片定影處理，用Super Signal West Femto最大靈敏度底物檢測系統(tǒng)(美國Pierce公司)來觀察免疫反應(yīng)帶，用Epson V200和Quantity One對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 NSCs鑒定體外分離的細胞原代培養(yǎng)至7 d左右，可見培養(yǎng)瓶中細胞形成球形集落，對取貼壁后的NSCs細胞球行神經(jīng)干細胞特異性蛋白Nestin熒光染色檢測，結(jié)果示貼壁細胞中大多細胞呈Nestin陽性表達，見圖2。

2.2 BMSC-CM對NSCs分化的影響第2代NSCs球接種后，培養(yǎng)7 d，細胞免疫熒光檢測顯示四組NSCs分化為MAP-2表達陽性的神經(jīng)元和GFAP表達陽性的星形膠質(zhì)細胞，見圖3。與對照組相比，BMSC-CM組的MAP-2陽性細胞顯著增加，GFAP陽性細胞顯著減少。與對照組相比，Jagged組 MAP-2陽性細胞明顯減少，GFAP陽性細胞明顯增加。而BMSC-CM+Jagged組較Jagged組MAP-2陽性細胞顯著增加，GFAP陽性細胞顯著減少。BMSC-CM+Jagged組較BMSC-CM組MAP-2陽性細胞顯著減少，GFAP陽性細胞顯著增加，見圖4、表1。Western blot分析顯示BMSC-CM組與對照組相比， MAP-2蛋白表達水平顯著增加，GFAP蛋白表達水平顯著減少。與對照組相比，Jagged組MAP-2蛋白表達水平明顯減少，GFAP蛋白表達水平明顯增加。而BMSC-CM+Jagged組較Jagged組MAP-2蛋白表達水平明顯增加，GFAP蛋白表達水平明顯減少。BMSC-CM+Jagged組較BMSC-CM組MAP-2蛋白表達水平顯著減少，GFAP蛋白表達水平顯著增加，見圖5、6和表2。BMSC-CM促進NSCs的有效分化。

圖2 神經(jīng)干細胞的免疫熒光鑒定 ×400A：Nestin蛋白表達水平；B：DAPI蛋白表達水平；C：融合圖像顯示神經(jīng)球中有大量Nestin蛋白表達

圖4 NSCs在不同分化培養(yǎng)基中分化后MAP-2陽性細胞率及GFAP陽性細胞率

A：對照組；B：Jagged組；C：BMSC-CM組；D：BMSC-CM+Jagged組；與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與BMSC-CM+Jagged組比較：#P<0.05，##P<0.01

表1 NSCs在不同分化培養(yǎng)基中MAP-2陽性細胞率及GFAP陽性細胞率比較

2.3 在BMSC-CM與NSCs共培養(yǎng)時Notch1信號通路被抑制為研究Notch1信號通路在BMSC-CM與NSCs共培養(yǎng)中的作用，采用Western blot方法檢測四組樣本的Notch1通路相關(guān)蛋白的表達。見圖6。結(jié)果顯示：BMSC-CM組與對照組相比， Notch1、NICD、Hes1、Hes5蛋白表達水明顯著減少；Jagged組與對照組相比，Notch1、NICD、Hes1、Hes5的蛋白表達水平明顯增加；BMSC-CM+Jagged組較Jagged組Notch1、NICD、Hes1、Hes5的蛋白表達水平明顯減少；BMSC-CM+Jagged組較BMSC-CM組Notch1、NICD、Hes1、Hes5的蛋白表達水平明顯增加。見圖7、8和表3。

圖5 NSCs在不同分化培養(yǎng)基中分化后的MAP-2及GFAP蛋白條帶A：對照組；B：Jagged組；C：BMSC-CM組；D：BMSC-CM+Jagged組

圖6 NSCs在不同分化培養(yǎng)基中分化后MAP-2及GFAP蛋白表達水平

A：對照組；B：Jagged組；C：BMSC-CM組；D：BMSC-CM+Jagged組；與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與BMSC-CM+Jagged組比較：#P<0.05，##P<0.01

表2 NSCs在不同分化培養(yǎng)基中分化后MAP-2及GFAP蛋白表達水平的比較

圖7 NSCs在不同分化培養(yǎng)基中分化后Notch1通路相關(guān)蛋白條帶A：對照組；B：Jagged組；C：BMSC-CM組；D：BMSC-CM+Jagged組

表3 NSCs在不同分化培養(yǎng)基中分化Notch1通路相關(guān)蛋白表達水平的比較

圖8 NSCs在不同分化培養(yǎng)基中分化后Notch1通路相關(guān)蛋白表達水平

A：對照組；B：Jagged組；C：BMSC-CM組；D：BMSC-CM+Jagged組；與對照組比較：*P<0.05,**P<0.01；與BMSC-CM+Jagged組比較：#P<0.05，##P<0.01

3 討論

本研究探討了BMSC-CM對NSCs分化的調(diào)控及可能機制。與對照組相比，用BMSC-CM培養(yǎng)NSCs 7 d后，通過細胞免疫熒光和Western blot分析顯示MAP-2蛋白表達水平比例增加，GFAP蛋白表達水平比例減少。這些結(jié)果表明，BMSC-CM對NSCs的分化有影響，顯著增加神經(jīng)元的比例，減少星形膠質(zhì)細胞的比例。將BMSCs移植到受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，可促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。以往的研究[10]表明，BMSCs在損傷后移植到小鼠脊髓內(nèi)，導(dǎo)致空洞體積明顯縮小，小鼠的運動和感覺恢復(fù)得到了改善。BMSCs與NSCs在體外共培養(yǎng)時，可以提供指導(dǎo)NSCs分化和促進軸突發(fā)育的指導(dǎo)性信號[11]，且BMSC-CM在體外對神經(jīng)元分化具有與BMSC相同的作用[12]。Notch信號通路可以調(diào)控NSC的自我更新、神經(jīng)發(fā)生和膠質(zhì)發(fā)生，激活Notch信號通路可以促進神經(jīng)膠質(zhì)發(fā)生，抑制NSC的神經(jīng)發(fā)生[13]。本研究以BMSC-CM組及BMSC-CM+Jagged組作為實驗組，通過BMSC-CM抑制被Jagged激活的Notch1通路，證明了BMSC-CM影響NSCs分化的潛在機制。Jagged是Notch1通路主要配體之一，Jagged蛋白能增加Notch1通路配體數(shù)量，直接激活Notch1通路。Notch信號通路主要通過跨膜受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch4)與相鄰細胞表面的跨膜配體(Jagged l,2和Delta-like 1,3,4)的物理結(jié)合激活。經(jīng)腫瘤壞死因子α-轉(zhuǎn)化酶作用，然后激活γ-分泌酶(γ-Secretase)[14]，促進NICD的釋放，NICD轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄抑制因子RBP-J結(jié)合，誘導(dǎo)下游靶基因(Hes1、Hes5等)的表達。為進一步研究其作用機制，通過應(yīng)用Notch1信號通路的特異性激活劑(Jagged融合蛋白)激活Notch1信號通路，通過免疫熒光和Western blot分析觀察上調(diào)Notch1信號通路對NSCs分化的影響。結(jié)果顯示，加入Jagged時Notch1信號后被激活，Notch1、NICD、Hes1、Hes5表達量明顯上調(diào)，NSCs向神經(jīng)元分化減少，NSCs向星形膠質(zhì)細胞分化增多。BMSC-CM組的Notch1、NICD、Hes1、Hes5表達量明顯降低，Notch1通路被抑制，從而調(diào)控了NSCs分化。BMSC-CM+Jagged組Notch1、NICD、Hes1和Hes5的表達較Jagged組明顯降低。這些結(jié)果表明，BMSC-CM可能是通過抑制Notch1信號通路調(diào)節(jié)NSCs的分化。此外，Notch1信號通路可能不是調(diào)節(jié)NSCs分化的唯一途徑，在BMSCs調(diào)控NSCs分化的過程中有多種信號通路參與，不同信號通路之間存在交叉作用。BMSC-CM可通過抑制BMP-4-smad1/5/8信號通路來調(diào)節(jié)NSCs的分化，增加神經(jīng)元的生成[5]，減少星形膠質(zhì)細胞的生成。因此聯(lián)合調(diào)控BMP4-SMAD1/5/8信號通路和Notch信號通路對NSCs的有效分化可能存在協(xié)同作用。目前BMSCs調(diào)控NSCs分化的機制尚沒有完全清楚，Notchl、Jaggedl、Hes1和Hes5可能是參與該調(diào)控的作用靶點，這為BMSC-CM誘導(dǎo)NSCs分化提供了新的理論支持。