LGR5啟動子甲基化在胃癌中的表達

陳曉雨，朱耀東，喻 鑫，劉 弋，于東風

2018年全球范圍內新增了100萬名胃癌患者，而且胃癌在惡性腫瘤中有著第五的發病率和第三的致死率，高致死率主要是晚期診斷所致[1]，為治愈帶來了巨大的困難，因此尋找胃癌新的腫瘤標志物及治療靶點成為了當今的熱點問題。富含亮氨酸的重復序列G蛋白偶聯受體5(leucine-rich repetitive G protein-coupled receptor 5 , LGR5)是癌癥干細胞(cancer stem cell,CSC)腫瘤標志物之一，在胃癌的發生發展中起著重要作用[2],然而LGR5表達調控的潛在機制仍不明確。研究[3]表明胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)島在不同基因啟動子區域的高(低)甲基化，可能是多種癌癥中腫瘤發生的主要原因。Su et al[3]發現在結直腸癌中LGR5啟動子的甲基化控制LGR5的表達影響腫瘤的進展，該研究探討胃癌中是否存在類似的機制。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取安徽醫科大學第一附屬醫院高新院區開診半年內的胃癌手術病例26份，胃癌確診依據該院病理科提供的術前術后病理報告。將26份病例納入隨訪，隨訪時間12個月。腫瘤分期采用TNM分期法。納入患者術前未接受新輔助放化療，也沒有合并其他惡性腫瘤。經安徽醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，受試者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 材料和試劑新鮮胃癌組織、癌旁組織、正常組織；EZ DNA甲基化金試劑盒(美國加利福利亞ZYMO公司)；TIANGEN凝膠萃取裝備(北京TIANGEN公司)；10×反應緩沖液及HotStartTaq聚合酶(大連TaKaRa公司)。

1.3 方法

1.3.1提取基因組DNA 采用標準苯酚-氯仿萃取法，從胃癌、癌旁、正常組織中提取基因組DNA。

1.3.2亞硫酸鹽修飾 利用EZ DNA甲基化試劑盒對提取后的基因組DNA進行亞硫酸氫鹽修飾，將基因組DNA未被甲基化修飾的胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U)。

1.3.3樣本目標片段多重PCR反應 以亞硫酸氫鹽處理過的DNA為模板，使用優化后的多重聚合酶鏈式反應(PCR)引物，以處理后的樣品基因組為模板，進行多重PCR擴增。經質控后，將以同一個樣品基因組DNA為模板的所有多重PCR引物的擴增產物混合，并確保每個位點引物擴增產物的量相當。引物序列(5’-3’)F：GGTTTTYGGAGTAGTTTTGGTTGT，R：ATAAAACCRAACRAAAAATACCTAAAAA。

1.3.4樣本添加特異性標簽序列 利用帶有Index序列的引物，通過PCR擴增向文庫末端引入和Illumina平臺兼容的特異性標簽序列。反應采用11個循環數的PCR程序，盡可能降低PCR的傾向性。

1.3.5定量后上機測序 將所有樣品Index PCR擴增產物等量混合，并經割膠回收獲得最終的Methyl Target測序文庫，文庫的片段長度分布經Agilent 2100 生物分析儀驗證。文庫摩爾濃度精確定量后，最終于IlluminaHiseq平臺，以2×150 bp的雙端測序模式進行高通量測序，獲得數據。

2 結果

2.1 一般情況本次研究中共納入26份胃癌病例，其中男女比為9:4,腫瘤位于賁門胃底胃體部與幽門部的病例數基本相等，III～IV期患者占38.46%，分化好的胃癌僅占30.77%，癌胚抗原(CEA)陽性的患者也僅占26.92%，其中19.23%的患者1年內發現腫瘤的復發。見表1。

2.2 LGR5在胃癌標本不同位置的甲基化測定并計算胃癌組織、癌旁組織、正常組織擴增子中不同位點LGR5啟動子CpG位點的甲基化水平(甲基化水平=該位點甲基化的reads數目/該位點總的reads數目)，結果每組胃癌組織中每個LGR5測量位點甲基化水平明顯降低，其中1例見圖1，測定位點數為15。另外以擴增子為單位，分析胃癌組織、癌旁組織、正常組織中LGR5啟動子CpG位點的單倍型，結果亦得出每組胃癌組織中LGR5甲基化水平明顯降低。見圖2。注：單倍型類型，假設擴增子序列(5’-3’)為：ATCATXGATCXGCTAXGCTTTAXG CCTAT，X可為c(甲基化修飾)或t(未甲基化修飾)，其中一條測序的read為：ATCATCGATCTGCTACGCTTTATGCCTAT，則該read對應的擴增子甲基化單倍型為：CTCT。

圖1 LGR5在不同組織中的甲基化水平

圖2 不同組織中LGR5啟動子CpG位點的單倍型

2.3 LGR5甲基化與胃癌臨床病理參數關系測定胃癌組織的LGR5啟動子區域CpG島甲基化水平，LGR5的甲基化水平較高預示著病理分期早、浸潤深度淺、腫瘤小、無淋巴轉移、1年內復發率低，見表1。

表1 LGR5甲基化與胃癌臨床病理參數關系

3 討論

癌癥起源于多種遺傳和表觀遺傳學變化的累積，受影響器官中的干細胞最有可能是癌癥的起源細胞，因為它們能夠自我更新并在多細胞分裂后長時間存活[4]。 CSC是一部分起源于未調控的干細胞或去分化的祖細胞并具有自我更新能力的細胞，同時擁有干細胞和上皮間充質轉換特征[5]。一系列的證據表明CSC負責腫瘤的發生、發展、維持、侵襲、轉移、再生、耐藥[3]，對于胃癌干細胞現已證實的標記物有分化抗體群(cluster of differentiation,CD)44、CD24、CD133、LGR5、結合轉錄因子4、上皮細胞粘附分子、乙醛脫氫酶1等[2]。

先前有研究[6-7]表明，LGR5在胃癌中表達增高，并與TNM分期與淋巴轉移相關，可作為胃癌侵襲、預后、抗幽門螺桿菌治療療效評估的指標。LGR5+細胞是胃癌的起源細胞，胃主細胞表達LGR5，并定植在腺體基底部，可作為上皮損傷后的儲備干細胞[4]。LGR5可激活WNT/β-連環蛋白通路，β-連環蛋白在細胞核中積累，調控多種靶基因的表達，影響胃癌的發生發展[8]。目前針對結直腸癌以及卵巢上皮癌的研究得出LGR5啟動子CpG島甲基化程度與腫瘤的發生、相關病理參數、良好的預后負相關[4,9]。在此，該文探究LGR5啟動子CpG島甲基化水平在胃癌中是否有相似的關系。

目前測定DNA甲基化仍多通過傳統方法，如甲基化特異PCR和亞硫酸氫鹽測序法的方法實現，通量小，且無法準確計算位點/區域的甲基化水平。該研究利用多重PCR和Methyl Target技術，實現對多個特定CpG島同時捕獲測序，并憑借高深度測序數據，能夠準確計算每個CpG位點的甲基化水平，準確性高，靈活性強。通過對26組標本進行測序并與相關臨床資料進行統計分析，得出LGR5的甲基化水平與胃癌病理分期、浸潤深度、腫瘤大小、淋巴轉移、1年內復發呈負相關。以此推斷LGR5啟動子區域CpG島甲基化水平下降導致LGR5表達增強，下調了CSC的分化、促進了胃癌的生長、轉移、再生。與以往關于LGR5在胃癌CSC表達的研究結果[7，10-11]基本一致。既往研究[10]表明分化較差、彌漫性、腸型及有遠處轉移的胃癌組織中LGR5表達較高，與該研究的結果不相符，可能是納入樣本量較少，造成了偏倚。并且在臨床中有部分IV期患者放棄手術治療，也可能導致了誤差。另外，臨床上認為CEA對于胃癌的診斷并沒有特異性，僅作為判斷預后和治療效果的參考指標，而該研究結果亦顯示LGR5啟動子區域CpG島甲基化水平與患者血清CEA水平并沒有表現出相關性。

上文提到LGR5與WNT/β-連環蛋白通路密切相關，在胃癌中WNT信號通路的活動水平增強[7]，結合該研究結果，可能是LGR5啟動子甲基化水平降低所致。LGR5的表達與胃癌血管形成正相關，與表達在小鼠胚胎的腫瘤壞死因子受體超家族成員負相關，與“叉頭”蛋白O1負相關，與“刺猬”基因/鋅子轉錄因子2信號通路負相關，與鋅指蛋白3負相關，與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白正相關，與R-脊椎蛋白正相關，與雙腎上腺皮質激素樣激酶1正相關，與重組人Nanog同源框假基因8正相關，與Notch信號通路正相關[5,7,9-12]。但這些因子或信號通路與LGR5甲基化的關系還未闡明，具有較好的研究前景。然而，DNA甲基化并不是調節CSC的唯一分子機制，組蛋白修飾、mircoRNA、染色質重塑等也可能在癌變中發揮作用[3]。

抗LGR5抗體綴合物及一些中藥如胃痞消與胃癌組織中LGR5的表達存在一定的相關性[13-14]。需要進一步研究這些藥物及新的藥物與LGR5甲基化的關系，為臨床藥物治療及新藥上市提供依據。

綜上，胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，該研究用定量的方法計算出LGR5在胃癌組織中的甲基化水平明顯降低，而且LGR5的甲基化水平與胃癌病理分期、浸潤深度、腫瘤大小、淋巴轉移、1年內復發相關。但是本次結果需要更大的樣本量進一步證實，而且與WNT/β-連環蛋白通路及其它相關因子的關系還有待探究，以此為胃癌的治療提供依據及新的方向。