鼠源pEGFP-C1-TMEM88真核表達質粒的構建及其功能研究

李良云，潘林鑫，楊俊發，胡 爽，張 濛，李 俊，徐 濤

跨膜蛋白88(transmembrane protein 88，TMEM88)發現于非洲爪蟾蜍胚胎細胞的細胞膜上，是一種潛在的2型跨膜型蛋白，在人類干細胞的蛋白質分化和胚胎發育中起關鍵作用。研究[1]表明，非小細胞肺癌組織和多種上皮惡性腫瘤中均有TMEM88高表達現象，并且主要定位于大多數癌癥組織的細胞質和肺癌細胞株中。而炎癥在癌癥的發展和進展中具有重要的作用，在調節免疫細胞在腫瘤微環境的進出中扮演關鍵角色，在抗腫瘤免疫中扮演重要角色。腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素6 (interleukin-6，IL-6)作為研究炎癥的代表性細胞因子，可以提高免疫功能，增強抗腫瘤免疫力[2]。課題組前期研究[3]表明在肝臟炎癥纖維化的模型中，TMEM88可以改善在Ⅰ型膠原1 和α-平滑肌肌動蛋白水平上轉化生長因子-β1誘導的肝星狀細胞的活化和增殖[3]。為進一步研究TMEM88對炎癥因子分泌的影響，課題組將通過構建TMEM88的真核質粒，研究其在RAW264.7細胞中炎癥因子(TNF-α、IL-6)的表達及其對細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料實驗材料 RAW264.7細胞株(中國科學院上海生命科學院)；ELISA(TNF-α、IL-6)試劑盒(武漢基因美公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司)；TMEM88抗體(美國SANTA CRUZ 公司)；ECL化學發光試劑盒(美國Thermo scientific公司)；細胞培養瓶、細胞培養板 (美國Corning Costar公司)；TRIzol Reagent RNA 提取試劑(美國Invitrogen公司)； PVDF膜(北京索萊寶科技有限公司)；脫脂牛奶(上海光明公司)；DMEM培養基；胎牛血清(美國Gibco公司)； Hind III、Kpn I內切酶、DL2000 DNA Marker、Lambda DNA Marker、T4連接酶、質粒抽提試劑盒(美國Axygen公司)。

1.2 方法

1.2.1構建質粒 在小鼠正常肝細胞株(alpha mouse liver 12，AML-12)中提取RNA，逆轉錄后的cDNA于-20 ℃ 保存。使用前，將引物(上海生工公司設計)取出適量稀釋到10 μmol/L，其余作為儲備液。采用常規PCR擴增技術，反應體系：5×PrimeSTAR Buffer、dNTP Mix(2.5 mmol/L)、上下游引物(10 μmol/L)、DNA、PrimeSTAR、高純水。取出5 μl PCR產物進行12%的瓊脂糖凝膠電泳，純化回收，并用Hind III、Kpn I雙酶切PCR產物和pEGFP-C1載體(分別置于紫外分析儀下觀察結果，使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒進行PCR產物TMEM88于0.5 ml的離心管中混勻，37 ℃水浴4～6 h)。先對酶切回收的載體進行克隆堿性磷酸酶處理，再進行粘性末端連接，然后進行連接產物的轉化、挑菌、搖菌、質粒小抽，酶切鑒定后，送至上海生工公司鑒定測序。

1.2.2轉染pEGFP-C1-TMEM88質粒 6孔板中培養RAW264.7細胞，待長至60%時，棄去培養基，PBS清洗3次。在1.5 ml EP管中，A液：200 μl的Opti-MEM加pEGFP-C1-TMEM88真核表達質粒1 μg；B液：200 μl的 Opti-MEM加LipofectamineTM2000脂質體4 μl，將AB液混勻靜置20 min后加入細胞中，再用Opti-MEM補至2 ml。轉染6 h后，更換含血清培養基繼續培養48 h后提取蛋白。

1.2.3Western blot實驗 棄去6孔板中的培養基，PBS清洗3遍，每孔用蛋白裂解液(RIPA裂解液：PMSF為100 ∶1)200 μl于冰上裂解細胞30 min，提取蛋白。利用Thermo NanoDrop 2000分光光度計檢測蛋白濃度。SDS-PAGE電泳，在恒流200 mA條件下濕轉60 min，5%牛奶中封閉3 h，孵育一抗β-actin、TMEM88過夜，室溫孵育二抗1 h，顯影試劑盒ECL 中A液與B液1 ∶1混合后，即可顯影拍照。

1.2.4MTT測細胞增殖 將RAW264.7細胞以每孔5 000的數量接種至96孔培養板中，待細胞長至70 %時開始轉染。每孔轉染約70 ng pEGFP-C1-TMEM88質粒，6 h后更換培養基。再培養48 h后每孔加入20 μl MTT，4 h后，用5 ml注射器棄去培養基，每孔加入150 μl DMSO，充分裂解10 min后，測定吸光度，計算細胞存活率。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 將RAW264.7細胞接種至6孔板中，分別轉染對照組空載體和pEGFP-C1-TMEM88質粒。48 h后收集細胞上清液，PBS清洗3次，胰酶消化細胞并收集于15 ml離心管中。每組用400 μl Binding Buffer重懸細胞，并加入5 μl Annexin V染液，避光孵育15 min，然后加入10 μl PI，避光孵育5 min，流式儀器檢測細胞凋亡率，觀察并記錄。

1.2.6ELISA 檢測炎癥因子 將RAW264.7細胞接種至6孔板中，分別轉染對照組空載體和pEGFP-C1-TMEM88質粒。每孔轉染1 μg的pEGFP-C1-TMEM88質粒，6 h后換成含血清的培養基，48 h后收集細胞上清。用ELISA試劑盒檢測細胞上清液中炎癥細胞因子IL-6、TNF-α的表達。

1.2.7實驗分組 正常組(N組)：不經任何處理的正常細胞分組；對照組(Control組)：轉染空載體pEGFP-C1的對照組；TMEM88組：轉染pEGFP-C1-TMEM88質粒的過表達組。

2 結果

2.1 pEGFP-C1-TMEM88真核表達質粒構建成功在小鼠肝細胞AML-12中提取RNA，逆轉錄后PCR擴增TMEM88的編碼序列(coding sequence，CDS)，利用Hind III、Kpn I雙酶切擴增產物和pEGFP-C1載體，并用T4 DNA連接酶連接兩產物。將其轉化到感受態大腸桿菌TG1，用抽提試劑盒提取質粒。酶切鑒定(Hind III、Kpn I雙酶切)結果顯示，重組質粒酶切后得到兩條亮帶，一條大小約4 700 bp，大小與pEGFP-C1的酶切產物基本一致，另一條大小約480 bp，大小與TMEM88的PCR產物基本一致，表明pEGFP-C1-TMEM88質粒連接成功，將陽性克隆送至上海生工公司鑒定測序，pEGFP-C1-TMEM88質粒成功構建，見圖1。

圖1 重組質粒 pEGFP-C1-TMEM88 的酶切鑒定

M1：DL2000 DNA Marker； M2：Lambda DNA Marker；1：TMEM88的PCR產物；2：pEGFP-C1-TMEM88的酶切鑒定；3：pEGFP-C1的酶切鑒定

2.2 pEGFP-C1-TMEM88真核表達質粒的表達將pEGFP-C1-TMEM88表達質粒轉染至RAW264.7細胞中，利用Western blot檢測其蛋白表達情況。結果顯示，過表達質粒組的TMEM88的蛋白表達量明顯高于Control組(F=134.64，P<0.01)；當用TMEM88抗體免疫印跡時，過表達TMEM88組分別在約17 ku(內源性TMEM88)和44 ku(GFP-TMEM88過表達，即27 ku + 17 ku)顯現蛋白印跡，而Control組僅在約17 ku(內源性TMEM88)的顯現蛋白印跡，表明pEGFP-C1-TMEM88能夠成功表達，見圖2。

圖2 重組質粒pEGFP-C1-TMEM88的蛋白表達

A：Western blot檢測重組質粒pEGFP-C1-TMEM88的蛋白表達；B：TMEM88蛋白表達圖；與Control組比較：**P<0.01

2.3 TMEM88對RAW264.7細胞增殖的影響MTT檢測將pEGFP-C1-TMEM88表達質粒轉染至RAW264.7細胞后的細胞增殖情況。結果顯示48 h后N組和Control組的細胞增殖率分別為(0.95±0.05)和(0.94±0.06)，過表達TMEM88組的細胞增殖率為(0.71±0.04)，顯著低于N組和Control組(F=21.55，P<0.01)，見圖3。

2.4 TMEM88對RAW264.7細胞凋亡的影響將生長對數期的RAW.264.7細胞中轉染pEGFP-C1-TMEM88質粒，48 h后用凋亡試劑盒在流式儀上檢測細胞凋亡率。結果顯示，N組的細胞凋亡率為(6.72±0.92)%，Control組的細胞凋亡率為(7.78±1.67)%，過表達TMEM88組的細胞凋亡率為(11.52±1.43)%，顯著高于Control組 (F=10.07，P<0.05)，結果顯示，過表達TMEM88后，能夠促進RAW.264.7細胞的凋亡，見圖4A、4B。

圖3 重組質粒pEGFP-C1-TMEM88對RAW264.7細胞增殖影響

與Control組比較：**P<0.01

2.5 TMEM88在RAW264.7細胞中對炎癥因子分泌的影響在RAW264.7細胞中轉染pEGFP-C1-TMEM88質粒，ELISA檢測細胞上清液中IL-6、TNF-α炎癥因子的表達。轉染后的過表達組中的IL-6表達較Control組升高 (F=18.78，P<0.05)；TNF-α的表達較Control 組升高 (F=22.77，P<0.05)，表明在RAW264.7細胞中，TMEM88促進炎癥因子IL-6、TNF-α的表達。見圖5。

3 討論

TMEM88是一種定位在17號染色體，分子量約為17 ku的雙跨膜蛋白，其CDS序列長度為477 bp，由159個氨基酸殘基組成的編碼[4-5]。通過抑制Wnt/β-連環蛋白經典通路[6]，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，從而抑制腫瘤的形成等[7]。而腫瘤又與炎癥密切相關[2]，所以課題組探究在RAW264.7細胞中，TMEM88對炎癥因子IL-6、TNF-α表達及其對細胞增殖凋亡的影響。RAW264.7細胞是研究病原菌感染吞噬、自噬、黏附后遞呈抗原的常用細胞株[8]，具有很強的黏附和吞噬抗原的能力，其中主要研究的炎癥細胞因子有IL-6、TNF-α[9]。TNF-α可由單核巨噬細胞、中性粒細胞、脂肪組織、肝細胞、Kupffer細胞等多種組織和細胞分泌。體內IL-6可由免疫細胞、內皮細胞、脂肪細胞、肝細胞分泌[10]。綜上，IL-6和TNF-α與炎癥的發生發展有關。大量實驗表明抑制這些炎癥因子的分泌有助于炎癥的治療[11]。

課題組前期構建了人源pEGFP-C2-TMEM88真核表達質粒，研究了其對肝癌細胞增殖和凋亡的影響，并已發表[7]。在此基礎上為了深入了解TMEM88的功能，該研究構建了鼠源pEGFP-C1-TMEM88的真核表達質粒，質粒構建酶切圖和Western blot結果顯示質粒成功構建和表達，接下來研究TMEM88對細胞增殖的影響。MTT結果顯示48 h后， N組的細胞增殖率為(0.95±0.05)；Control 組的細胞增殖率為(0.94±0.06)；過表達TMEM88組的細胞增殖率為(0.71±0.04)，顯著低于N組(F=21.55，P<0.01)。結果表明，過表達TMEM88能夠明顯抑制RAW264.7細胞的增殖。細胞凋亡檢測結果顯示：N組的細胞凋亡率為(6.72±0.92)%，Control組的細胞凋亡率為(7.78±1.67)%，過表達TMEM88組的細胞凋亡率 (11.52±1.43) %，顯著高于Control組(F=10.07，P<0.05)，過表達pEGFP-C1-TMEM88后的細胞凋亡率顯著高于N組。表明過表達TMEM88能夠顯著促進RAW.264.7的凋亡。ELISA結果顯示：過表達TMEM88后，IL-6、TNF-α的表達升高。表明TMEM88促進炎癥因子IL-6和TNF-α的表達。據文獻[12]顯示，TNF-α和IL-6有明顯的肝臟毒性，可引起肝細胞壞死，造成肝功能損傷。因為IL-6和TNF-α二者均能激活T淋巴細胞、B淋巴細胞，單核巨噬細胞和自然殺傷細胞與肝細胞膜受體發生免疫應答反應，造成肝細胞壞死。因此研究IL-6和TNF-α的表達對今后研究TMEM88在肝臟上炎癥的表達奠定了基礎。該研究結果表明TMEM88在RAW264.7細胞的增殖和凋亡中起關鍵作用，抑制細胞的增殖并促進細胞的凋亡，且對炎癥具有一定的促進作用。這為今后炎癥的治療打下了堅實的基礎，課題組將繼續深入探討TMEM88與炎癥的關系及機制。

圖4 重組質粒pEGFP-C1-TMEM88對RAW264.7細胞凋亡的影響 A：過表達TMEM88流式細胞術檢測結果；B：細胞凋亡率柱狀圖；與Control組比較：*P<0.05

圖5 重組質粒pEGFP-C1-TMEM88轉染后 ELISA檢測炎癥因子IL-6和TNF-α的表達 與Control組比較：*P<0.05