半乳糖凝集素-1對(duì)LTA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體的抑制及機(jī)制探討

陳方方，王木子，呂允相，劉榮玉

炎癥小體是細(xì)胞在感染或應(yīng)激情況參與機(jī)體先天免疫防御的一種分子平臺(tái)，在協(xié)助機(jī)體抵御病原體感染和組織損傷中發(fā)揮重要作用[1]。目前已發(fā)現(xiàn)的炎性小體主要有4種，即NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM2。研究[1]認(rèn)為NLRP3炎癥小體是目前最具有特征的炎癥小體，是由NLRP3、ASC(PYCARD)和Caspase-1組成。NLRP3炎性小體通過識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)或者宿主來源的危險(xiǎn)信號(hào)分子模式(damage associated molecular patterns，DAMP)招募和激活促炎癥蛋白酶Caspase-1；活化的Caspase-1切割I(lǐng)L-1β和IL-18的前體,產(chǎn)生相應(yīng)的成熟細(xì)胞因子IL-1β和IL-18，誘導(dǎo)炎癥發(fā)生。因此，基于 NLRP3 炎癥小體的抗炎藥物開發(fā)及作用機(jī)制的研究對(duì)于炎癥相關(guān)疾病的防治具有重要意義。

半乳糖凝集素-1(galectin-1，Gal-1)是動(dòng)物半乳糖凝集素家族中的一員，可通過識(shí)別β-半乳糖來發(fā)揮廣泛的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[2]，近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)，在先天性免疫反應(yīng)中，Gal-1通過抑制促炎癥細(xì)胞因子的合成，抑制中性粒細(xì)胞運(yùn)輸，靶向抑制嗜酸性粒細(xì)胞遷移并促進(jìn)其凋亡，抑制肥大細(xì)胞脫顆粒，并且可以通過控制L-精氨酸的代謝及減少NO的產(chǎn)生誘導(dǎo)骨髓巨噬細(xì)胞向M2型分化，從而發(fā)揮抗炎作用。Gal-1在巨噬細(xì)胞炎癥中具有廣泛的抗炎作用，但具體的分子機(jī)制仍不明了。因此,該研究擬通過探討重組鼠源性半乳糖凝集素-1(recomblant mouse galectin-1，rmGal-1)干預(yù)對(duì)金黃色葡萄球菌脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)刺激Raw264.7 巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型的影響,研究外源性Gal-1對(duì)NLRP3 炎癥小體活化的調(diào)節(jié)和相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步了解其藥理學(xué)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 小鼠單核巨噬細(xì)胞系Raw264.7購于上海細(xì)胞庫。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、小牛血清購于美國Invitrogen公司；LTA購于美國Sigma公司；rmGal-1試劑購于北京sino biological公司；P-p65、p65和NLRP3 單克隆抗體購于美國Cell Signaling 公司；ASC、Galectin-1、Caspase-1單克隆抗體購于美國Santa Cruz Biotechnology 公司；JSH-23(NF-κB)購于美國MedChemExpress公司；辣根過氧化物酶(HRP) 標(biāo)記的 GAPDH一抗購于四川康城公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔和兔抗鼠二抗購于美國Santa Cruz Biotechnology公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購于美國Corning公司；LSM510激光共聚焦顯微鏡購于德國ZEISS公司；蛋白電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)Raw264.7 細(xì)胞用含5% 胎牛血清、5%小牛血清、100 U/L青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，觀察細(xì)胞整體情況1～2 d，根據(jù)細(xì)胞數(shù)目、形態(tài)及培養(yǎng)基顏色進(jìn)行細(xì)胞換液，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到90%時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]法檢測(cè)rmGal-1作用下Raw 264.7細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Raw264.7細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液的濃度為5×104個(gè)/ml，接種于96孔板內(nèi)(100 μl/孔)，恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h后，待細(xì)胞完全貼壁，分別加入0、0.04、0.4、4 μg/ml的rmGal-1(100 μl/孔)處理72 h，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在終止前4 h，每孔加10 μl MTT，MTT干預(yù)結(jié)束后去上清液，再加100 μl 二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)，震蕩混勻10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定吸光度(optical density，OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率=(OD實(shí)驗(yàn)組-OD實(shí)驗(yàn)對(duì)照組)/OD對(duì)照組×100%。

1.2.3建立LTA刺激巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)模型 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7按1×106/ml 的密度分別接種12孔板，培養(yǎng)過夜至24 h。設(shè)置時(shí)間梯度0、1、3、6 h，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，用LTA(2.5 μg/ml)干預(yù)細(xì)胞3 h后提取細(xì)胞蛋白。

1.2.4rmGal-1干預(yù)LTA刺激下的巨噬細(xì)胞 同樣將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7按1×106/ml的密度分別接種12孔板中。將實(shí)驗(yàn)分為四組；即空白對(duì)照組(Control組)、炎癥模型組(LTA組)、藥物對(duì)照組(rmGal-1組)、干預(yù)組(LTA+rmGal-1組)。預(yù)先用rmGal-1(0.4 μg/ml)預(yù)處理72 h,再加入LTA共孵育3 h后提取細(xì)胞蛋白。

1.2.5JSH-23干預(yù)LTA刺激下的巨噬細(xì)胞 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7按1×106/ml的密度接種于12孔板，培養(yǎng)過夜至24 h。將實(shí)驗(yàn)分為四組：即空白對(duì)照組(Control組)、炎癥模型組(LTA組)、藥物對(duì)照組(JSH-23組)、干預(yù)組(LTA+JSH-23組)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加入30 μmol/mL JSH-23預(yù)處理1 h后加入LTA共孵育3 h后提取細(xì)胞蛋白。

1.2.6激光共聚焦觀察P-p65及NLRP3炎癥小體的表達(dá)水平 用洗潔精處理過的玻片放入超聲儀內(nèi)超聲，再用超純水沖洗，放在75%酒精里浸泡，使用時(shí)拿出酒精內(nèi)的玻片過火灼燒，放入板內(nèi)，多聚賴氨酸包被過夜，再用PBS洗3次，放入溫箱3～4 h,玻片烘干。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Raw264.7按1×106/ml的密度接種于12孔板，培養(yǎng)過夜至24 h，分別加入rmGal-1(0.4 μg/ml)預(yù)處理72 h或JSH-23預(yù)處理(30 μmol/ml)1 h,再加入LTA共處理3 h。4%多聚甲醛固定30 min后，羊血清封閉30 min，吸棄血清后一抗37 ℃室溫孵育1 h后4 ℃過夜，加入熒光二抗室溫孵育1 h后，4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染核15 min，甘油封片，透明指甲油固定封片的四角，4 ℃冰箱保存用于拍照。激光共聚焦顯微鏡下取6個(gè)視野拍照，觀察細(xì)胞形態(tài)及胞內(nèi)熒光強(qiáng)度。

1.2.7蛋白提取和Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 收獲細(xì)胞，提取蛋白后電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫封閉，相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜(稀釋比例為P-p65：1 ∶1 000；p65：1 ∶1 000；NLRP3：1 ∶2 000；ASC：1 ∶200；Caspase-1：1 ∶200；Gal-1：1 ∶100；Pro-Caspase-1：1 ∶500)，洗滌后室溫孵育HRP標(biāo)記二抗1 h，最后ECL試劑盒中A液和B液等體積混勻后均勻加至膜上，化學(xué)發(fā)光成像 ChemiScope顯影,Image J軟件分析條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 rmGal-1對(duì)Raw264.7 細(xì)胞活力的影響0、0.04、0.4、4 μg/ml終濃度的rmGal-1與Raw264.7細(xì)胞共孵育72 h，MTT法測(cè)得各組細(xì)胞活力相對(duì)百分比，結(jié)果均用(%)表示。在0 μg/ml時(shí)，細(xì)胞活力是(97.23±3.07)；濃度為0.04 μg/ml時(shí)，檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果是(81.76±9.10)；0.4 μg/ml濃度梯度時(shí)，細(xì)胞活力是(80.89±7.63)；濃度為4 μg/ml時(shí)細(xì)胞活力下降到(20.06±5.26)；與對(duì)照組(0 μg/ml)相比，rmGal-1濃度在0.04 μg/ml及0.4 μg/ml對(duì)細(xì)胞活力無明顯影響，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而在4 μg/ml時(shí)顯著影響細(xì)胞活力(F=112.78,P<0.01)。rmGal-1是一種重組鼠源性蛋白，在不明顯影響Raw264.7 細(xì)胞活力的情況下，根據(jù)MTT法測(cè)得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇0.4 μg/ml為實(shí)驗(yàn)濃度。

2.2 LTA誘導(dǎo)Raw246.7巨噬細(xì)胞中NF-κB-NLRP3通路活化并促進(jìn)內(nèi)源性Gal-1高表達(dá)LTA(2.5 μg/ml)刺激巨噬細(xì)胞1、3、6 h，Western blot法分析P-p65、NLRP3、Gal-1分子的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LTA刺激Raw246.7巨噬細(xì)胞活化NF-κB-NLRP3通路呈時(shí)間依賴性。在LTA刺激下，隨時(shí)間延長(zhǎng),內(nèi)源性Gal-1的表達(dá)水平顯著增高(F=3.56,P<0.05)，且P-p65、NLRP3及Gal-1的表達(dá)水平在刺激3 h后達(dá)到高峰(圖1)。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)LTA刺激Raw264.7的最佳時(shí)間為3 h。

2.3 rmGal-1和JSH-23預(yù)處理后對(duì)Raw264.7 巨噬細(xì)胞中NF-κB及NLRP3炎癥小體表達(dá)的影響免疫熒光結(jié)果顯示，LTA刺激Raw264.7細(xì)胞3 h后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)綠色熒光NLRP3及P-p65表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增強(qiáng)(圖2)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)采用Western blot對(duì)細(xì)胞內(nèi)NLRP3和P-p65蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，LTA組細(xì)胞內(nèi)NLRP3及P-p65表達(dá)水平顯著升高，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3)。此外，用rmGal-1預(yù)處理72 h后，與LTA共孵育3 h,免疫熒光結(jié)果顯示LTA和rmGal-1共孵育組綠色熒光NLRP3及P-p65的表達(dá)明顯低于LTA組(圖2)。這表明rmGal-1抑制了NLRP3及P-p65在細(xì)胞

圖1 LTA刺激Raw264.7巨噬細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)P-p65、 NLRP3和Gal-1的蛋白表達(dá)及蛋白水平的半定量分析

A：各蛋白的蛋白表達(dá)；B:各蛋白的蛋白半定量分析；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01

內(nèi)的表達(dá)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與LTA組相比，LTA+rmGal-1組細(xì)胞內(nèi)NLRP3及P-p65的表達(dá)水平顯著降低。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.37，P<0.05或F=4.77，P<0.01)(圖3)。這進(jìn)一步證明了rmGal-1可以抑制NLRP3及P-p65在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。與此同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)用NF-κB抑制劑(JSH-23)預(yù)處理1 h后，與LTA共孵育3 h作為陽性對(duì)照,免疫熒光和Western blot結(jié)果一致，顯示與LTA組相比，JSH-23+LTA組細(xì)胞內(nèi)NLRP3及P-p65的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.15，P<0.01；F=5.69，P<0.01)(圖2、3)。NF-κB抑制劑陽性對(duì)照處理結(jié)果同rmGal-1處理后一致。

3 討論

該實(shí)驗(yàn)把小鼠巨噬細(xì)胞系Raw264.7作為研究對(duì)象，分別用rmGal-1和NF-κB抑制劑JSH-23干預(yù)金黃色葡萄球菌LTA刺激Raw264.7細(xì)胞的炎癥模型。研究結(jié)果顯示，在LTA刺激Raw264.7細(xì)胞3 h后，內(nèi)源性Gal-1及NLRP3炎癥小體表達(dá)顯著上調(diào)；rmGal-1預(yù)處理后顯著抑制P-p65、NLRP3、ASC及Caspase-1表達(dá)。同樣地，JSH-23預(yù)處理后，P-p65、NLRP3、ASC及Caspase-1的表達(dá)水平顯著下調(diào)。

圖2 免疫熒光法測(cè)rmGal-1和JSH-23處理后各組Raw264.7細(xì)胞中P-p65及NLRP3炎癥小體的表達(dá) ×200

A：加rmGla-1處理后各組P-p65表達(dá)；B：加抑制劑(JSH-23)處理后各組P-p65表達(dá)；C：加藥(rmGla-1)處理后各組NLRP3表達(dá)；D：加抑制劑(JSH-23)處理后NLRP3表達(dá)；DAPI所染的細(xì)胞核呈藍(lán)色,綠色熒光為P-p65和NLRP3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

巨噬細(xì)胞作為主要的固有免疫細(xì)胞，具有抗原提呈，清除病原體和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能[4]。研究[4-5]表明，輕度哮喘患者肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多，吞噬功能增強(qiáng)，提示肺泡巨噬細(xì)胞可能參與哮喘的發(fā)病。金黃色葡萄球菌作為常見的人類定植細(xì)菌，與哮喘等過敏性疾病的發(fā)病有關(guān)[6]；LTA作為金黃色葡萄球菌的主要成份,可以被巨噬細(xì)胞表面Toll樣受體2(Toll like receptor-1, TLR2)識(shí)別誘導(dǎo)炎癥發(fā)生[7]。研究[8]表明在大腸桿菌感染的小鼠膿毒血癥的動(dòng)物模型中NLRP3炎癥小體表達(dá)上調(diào)，此外還有研究[9]顯示LTA可激活牛乳腺泡細(xì)胞TLR2/NF-κB/NLRP3信號(hào)通路誘發(fā)乳腺炎。糞腸球菌LTA刺激巨噬細(xì)胞系Raw264.7建立的牙周炎的模型里顯示[10]，LTA可誘導(dǎo)Raw264.7細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的活化，而且該作用可能與ROS和NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)。與之前的研究結(jié)果相一致，該研究表明金黃色葡萄球菌LTA刺激Raw264.7細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)NLRP3、ASC及Caspase-1的表達(dá)水平顯著升高。這表明LTA激活了Raw264.7細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎癥小體的表達(dá)和組裝。該研究也證明，LTA刺激Raw264.7細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)P-p65表達(dá)水平也顯著升高，這表明LTA同時(shí)激活了NF-κB信號(hào)通路。這進(jìn)一步證實(shí)了LTA可能通過激活NF-κB來上調(diào)NLRP3的表達(dá)[9-10]。

圖3 rmGal-1和JSH-23處理后對(duì)NF-κB/NLRP3炎癥小體通路蛋白表達(dá)的影響及蛋白水平半定量分析

A：加rmGal-1后各蛋白的表達(dá)；B：各蛋白的蛋白半定量分析；C：加抑制劑(JSH-23)后各蛋白的表達(dá)；D：各蛋白的蛋白半定量分析；a:空白對(duì)照組；b：LTA組；c：rmGal-1組；d：LTA+rmGal-1組；1：空白對(duì)照組；2：LTA組；3：JSH-23組；4：LTA+JSH-23組；與LTA組比較：*P<0.05，**P<0.01

Gal-1是一種碳水化合物結(jié)合蛋白，在細(xì)胞外，Gal-1能夠與各種免疫細(xì)胞表面的二價(jià)或多價(jià)聚糖相互識(shí)別而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用；在細(xì)胞內(nèi)，Gal-1可參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并調(diào)節(jié)一系列病理生理反應(yīng)[11]。有研究[12]表明，克氏錐形蟲感染巨噬細(xì)胞后，內(nèi)源性Gal-1表達(dá)升高，外源性加入Gal-1可以顯著抑制克氏錐形蟲刺激巨噬細(xì)胞后炎癥因子的產(chǎn)生，明確了外源性Gal-1的體外抗炎作用[13]，這些研究與該實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。該研究采用LTA刺激巨噬細(xì)胞Raw264.7后，內(nèi)源性Gal-1表達(dá)水平明顯升高。同時(shí)，該實(shí)驗(yàn)用外源性rmGal-1作用于Raw264.7細(xì)胞后表明，LTA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體表達(dá)水平顯著下降。這進(jìn)一步證實(shí)了外源性Gal-1在體外的抗炎作用。有研究[14]顯示內(nèi)源性Gal-1可以通過與NF-κB相互作用而調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。該研究顯示，LTA刺激Raw264.7細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)P-p65、Caspase-1、ASC和NLRP3表達(dá)水平顯著升高，這表明LTA刺激巨噬細(xì)胞激活了NK-κB-NLRP3信號(hào)通路，給予外源性Gal-1后，顯著抑制了巨噬細(xì)胞內(nèi)P-p65、Caspase-1、ASC和NLRP3表達(dá)水平。這表明，rmGal-1可能通過抑制NK-κB-NLRP3信號(hào)通路來調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。為了進(jìn)一步證實(shí)以上推論，該實(shí)驗(yàn)給予NF-κB抑制劑預(yù)處理Raw264.7細(xì)胞作為陽性對(duì)照，在LTA刺激巨噬細(xì)胞后顯示，細(xì)胞內(nèi)P-p65、Caspase-1、ASC和NLRP3表達(dá)水平顯著下調(diào)。這一作用與rmGal-1作用效果相一致。

綜上，該研究證實(shí)了金黃色葡萄球菌 LTA刺激Raw264.7 巨噬細(xì)胞可活化NLRP3炎癥小體，誘導(dǎo)內(nèi)源性Gal-1的表達(dá)升高，rmGal-1干預(yù)可顯著抑制LTA刺激巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，可能與rmGal-1抑制NF-κB/NLRP3信號(hào)通路有關(guān)，這為哮喘等炎癥相關(guān)疾病的治療提供了新的依據(jù)。但rmGal-1對(duì)NLRP3炎癥小體調(diào)控作用除通過NF-κB通路外，還可能與其影響其他調(diào)控炎癥因子表達(dá)的途徑有關(guān)，這些炎癥通路間是否有一定的交互調(diào)控，仍需進(jìn)一步的探究。