鹽酸小檗堿對肝纖維化大鼠腸道黏膜屏障的保護作用及機制

李 震，劉 偉，候桂琴

肝纖維化是多種慢性肝病進展的共同病理過程，是我國嚴重的公共衛生問題，同時也是患者進展為肝硬化甚至死亡的主要病因[1-2]。肝纖維化的發病機制十分復雜，傳統研究普遍認為肝臟纖維化的形成主要包括肌成纖維細胞的形成和細胞外基質沉積兩個連續的過程。但近年研究[3-4]顯示肝纖維化與腸道黏膜屏障損傷有關。研究[5-7]表明，鹽酸小檗堿具有抑菌和改善腸道菌群的作用，但尚不確定其是否對腸道屏障有保護作用。基于此，該實驗擬通過肝纖維化模型探討鹽酸小檗堿對肝纖維化腸道黏膜屏障的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 健康SPF級雄性SD大鼠，40只，體質量為200～220 g,由湖北省實驗動物研究中心提供，許可證號:SCXK(鄂)2015-0018。

1.1.2主要藥品及試劑 CCl4購自上海展云化工有限公司，批號20180112；鹽酸小檗堿購自吉林省臨江市健今藥業有限責任公司，批號20180412；果糖口服溶液購自萊陽江波制藥有限責任公司，批準文號：國藥準字H20074010，生產批號：180721；丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)生化試劑盒購自南京建成生物技術有限公司，批號分別為20180712、20180614、20180523。大鼠透明質酸(hyaluronic acid，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、IV型膠原蛋白(type IV collagen, IV-C)及內毒素ELISA試劑盒、二抗(HRP標記山羊抗大鼠抗體)、內參(β-actin)均購自武漢巴菲爾生物技術有限公司，批號分別為1800405、180610、180326、180617、20180528、20180412；Takara逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq[TM]購自大連Takara公司，批號分別為M9004、A2801；閉合蛋白(Claudins)、閉鎖連接蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)為兔抗鼠抗體，購自英國Abcam公司，批號分別為ab216327、ab150077。

1.1.3主要儀器 AE224型分析天平購自上海舜宇恒平科學儀器有限公司；FastTrackTM型紫外分光光度計購自上海梅特勒-托利多有限公司；Genova Bio型核酸蛋白分析儀購自蘇州艾泰赫生化科技有限公司；9700型PCR擴增儀購自美國ABI公司；WD-9413C型凝膠成像分析系統購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1動物分組 適應性飼養1周后將大鼠隨機分為正常對照組(control group,CON組)、模型組(model group,MOD組)、乳果糖口服液組(lactulose oral liquid group,LOL組)和鹽酸小檗堿組(berberine hydrochloride group,BH組)，每組10只，除CON組外，其他各組制作肝纖維化模型。

1.2.2肝纖維化模型的建立 參考文獻[6]制作肝纖維化模型：MOD組、LOL組和BH組按0.1 ml/100 g的劑量腹腔注射50% CCl4橄欖油溶液,2次/周，共12周。CON組按0.1 ml/100 g的劑量腹腔注射橄欖油溶液，2次/周，共12周。

1.2.3給藥 灌胃和給藥同時進行，每天上午定時造模，下午定時給藥，即LOL組按100 mg/kg的劑量灌胃乳果糖口服溶液，BH組按150 mg/kg的劑量灌胃鹽酸小檗堿藥液，灌胃容積均為10 ml/kg，CON組和MOD組按10 ml/kg的劑量灌胃生理鹽水，連續灌胃12 周，1次/d。

1.2.4指標檢測

1.2.4.1 肝臟指數和脾臟指數 末次灌胃結束后24 h取材，稱重，用10%水合氯醛溶液按0.3 ml/100 g的劑量麻醉，麻醉好后經腹主動脈取血，分離肝臟和脾臟，剝離脂肪韌帶，擦干血水，稱取肝脾重量，計算臟器指數，臟器指數=臟器質量(g)/體質量(g) ×100%。

1.2.4.2 血清酶檢測 采血后離心取上清液，檢測各組大鼠血清酶的表達水平，檢測步驟按照各指標的說明書進行。

1.2.4.3 血清HA、LN、IV-C及血清內毒素檢測 采血后離心取上清液，用ELISA檢測各組大鼠HA、LN、IV-C和內毒素的表達水平，檢測步驟按照各指標的說明書進行。

1.2.4.4 肝臟和腸道病理學檢測 稱重后，取肝右葉和回腸，置4%多聚甲醛固定48 h,用HE染色觀察肝臟和回腸的病理改變。

1.2.4.5 RT-PCR檢測回腸中Claudins、ZO-1 mRNA表達水平 用RT-PCR檢測檢測回腸中Claudins、ZO-1 mRNA表達水平。取血后，分離回腸，稱取50 mg。參照TRIzol說明書提取回腸總mRNA，用核酸蛋白儀檢測純度，純度為1.8～2.2即可進行下一步；按照Takara逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq[TM]試劑盒說明書依次添加試劑，用PCR儀進行基因擴增。每個基因重復3次，用2-△△Ct表示mRNA相對表達水平。Claudins、ZO-1及內參β-actin序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4.6 Western blot檢測回腸中Claudins、ZO-1的蛋白表達 用Western blot檢測4組大鼠回腸中Claudins、ZO-1的蛋白表達量，內參為GAPDH。取肺組織50 mg,加蛋白裂解液,冰上研磨，以4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清液，用BCA蛋白質試劑盒分別測定4組蛋白量；依次加樣、凝膠電泳、轉膜和室溫封閉；按抗體說明書加入一抗Claudins(1 ∶300)和一抗ZO-1(1 ∶200)，置4 ℃冰箱過夜，洗膜，再加入二抗(1 ∶1 000)，ECL顯色；置于凝膠圖像成像分析系統，曝光各組蛋白條帶，拍照。

2 結果

2.1 肝臟指數和脾臟指數與CON 組相比，MOD組大鼠肝臟指數和脾臟指數都明顯升高(P<0.01)；與MOD組相比，LOL組和BH組大鼠肝臟指數和脾臟指數均有不同程度降低(P<0.01，P<0.05)，其中BH組下降最為明顯。見表2。

2.2 血清酶的檢測結果與CON組相比，MOD組大鼠血清中ALT、AST、ALP明顯升高(P<0.01)；MOD組相比，LOL組和BH組大鼠血清中ALT、AST、ALP均有不同程度降低(P<0.01，P<0.05)，其中BH組下降最為明顯，見表3。

2.3 血清HA、LN、IV-C及血清內毒素檢測結果

表2 各組大鼠肝臟指數和脾臟指數檢測結果

與CON 組比較：**P<0.01；與MOD組比較：#P<0.05，##P<0.01

表3 各組大鼠血清酶檢測結果

與CON 組比較：**P<0.01；與MOD組比較：#P<0.05，##P<0.01

與CON組相比，MOD組大鼠血清中HA、LN、IV-C及內毒素明顯升高(P<0.01)；與MOD組相比，LOL組和BH組大鼠血清中HA、LN、IV-C及內毒素均有不同程度降低(P<0.01，P<0.05)，其中BH組下降最為明顯，見表4。

2.4 病理組織學結果肝臟HE染色：CON組大鼠肝細胞大小均勻，排列整齊，肝索和肝小葉結構完整且排列整齊。MOD組大鼠肝細胞大小不一，排列紊亂，肝小葉和肝索結構紊亂，可見氣球樣變、空泡樣變和炎性細胞浸潤。LOL組和BH組大鼠肝細胞、肝小葉、肝索的病理形態都明顯優于MOD組，也存在少量的炎性細胞浸潤。見圖1。回腸 HE 染色：CON組大鼠回腸腸絨毛結構較完整、整齊排列，未見絨毛脫落、倒伏的現象，上皮黏膜間無明顯炎性細胞浸潤。MOD組大鼠回腸有絨毛排列紊亂，絨毛變短，腸黏膜充血、水腫，存有明顯的炎性細胞浸潤。LOL組和BH組回腸腸黏膜充血、水腫及炎性細胞浸潤明顯改善。見圖2。

2.5 RT-PCR檢測結果CON組大鼠回腸中Claudins、ZO-1 mRNA表達水平較高，造模后，MOD組大鼠回腸中Claudins、ZO-1 mRNA表達水平降低(P<0.01)，給藥后，LOL組和BH組大鼠回腸中Claudins、ZO-1 mRNA表達水平升高(P<0.05)，其中BH組上升最為明顯。見表5。

2.6 Western blot檢測結果CON組大鼠回腸中Claudins、ZO-1蛋白表達水平較高，造模后，MOD組大鼠回腸中Claudins、ZO-1蛋白表達水平降低(P<0.01)，給藥后，LOL組和BH組大鼠回腸中Claudins、ZO-1蛋白表達水平升高(P<0.01，P<0.05)，其中BH組上升最為明顯。見表6、圖3。

表4 各組大鼠血清HA、LN、IV-C及血清內毒素檢測結果

與CON 組比較：**P<0.01；與MOD組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖1 各組大鼠肝組織HE染色結果 ×400A：MOD組；B：CON組；C：LOL組；D：BH組

圖2 各組大鼠回腸HE染色結果 ×400A：MOD組；B：CON組；C：LOL組；D：BH組

表5 各組大鼠回腸中Claudins、ZO-1 mRNA的表達水平

與CON 組比較：**P<0.01；與MOD組比較：#P<0.05，##P<0.01

表6 各組大鼠回腸中Claudins、ZO-1的灰度值

與CON 組比較：**P<0.01；與MOD組比較：#P<0.05，##P<0.01

圖3 各組大鼠回腸中Claudins、ZO-1蛋白條帶圖A：CON組；B：MOD組；C：LOL組；D：BH組

3 討論

CCl4是動物實驗中誘導肝纖維化最廣泛使用的藥物，一般而言，腹腔注射吧CCl415 min后即可造成肝損傷，48 h肝損傷達高峰，此后肝臟進入修復期，因此給藥3～4 d就可形成肝纖維化[8]。該實驗每周2次腹腔注射50% CCl4橄欖油溶液，連續造模12周。肝臟HE染色結果顯示，MOD組大鼠肝細胞大小不一，排列紊亂，肝小葉和肝索結構紊亂，可見氣球樣變、空泡樣變和炎性細胞浸潤。ALT、AST、ALP是評價肝功能的重要指標，該研究顯示，造模后模型組大鼠血清中ALT、AST、ALP明顯升高(P<0.01)。肝纖維化是許多慢性肝病的共同病理過程，肝臟細胞外基質(extracellular matrix，ECM)彌漫性沉積為其主要病理特征[9-10]。ECM的主要成分是膠原，IV-C是ECM的重要成分之一，而HA和LN是IV-C形成的主要成分，因此IV-C、HA和LN對于肝纖維化的診斷具有重要意義。該實驗表明，MOD組大鼠血清中IV-C、HA和LN的含量明顯高于CON組。綜合HE染色結果、血清酶檢測結果和IV-C、HA、LN檢測結果，該實驗成功通過CCl4誘導建立了肝纖維化大鼠模型。

腸道黏膜屏障主要由機械屏障、免疫屏障、化學屏障和生物屏障四部分組成，是防止腸道內有害物質和病原體進入機體內環境，并維持機體內環境穩定的一道重要屏障。該屏障中任何一功能出現紊亂，均可引發細菌和內毒素的異位。

研究[11]表明肝纖維化中有明顯的腸道機械屏障損傷。腸道機械屏障損傷主要表現為腸道通透性增高。腸道黏膜機械屏障由腸上皮細胞及細胞間的緊密連接蛋白構成，因此腸道黏膜上皮間的緊密連接(tight junctions，TJ)對于維持腸道黏膜機械屏障的完整性尤為關鍵[12]。TJ由許多緊密連接蛋白組合構成，如咬合蛋白(occludin)、閉合蛋白(Claudin家族)和閉鎖連接蛋白(zonula occludens, ZOs)，其中Claudins和ZO-1最具代表，二者常被視為腸道機械屏障的核心指標[13]。Claudins蛋白對腸道黏膜機械屏障起決定性作用，主要存在于腸道上皮細胞間的TJ，一般情況下僅允許小分子進入。ZO-1的氨基端與Claudins羧基端相連，可將Claudins與細胞骨架連接起來[14]。Claudins和ZO-1相互連接構成腸道黏膜機械屏障，二者表達減少時會導致腸道黏膜的通透性增加，從而使腸道黏膜的保護作用減弱[15]。該實驗表明，MOD組大鼠回腸有絨毛排列紊亂，絨毛變短，腸黏膜充血、水腫，存有明顯的炎性細胞浸潤，同時回腸中Claudins、ZO-1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低，因此，肝纖維化會伴隨腸道機械屏障功能受損，其受損原因可能與回腸中Claudins、ZO-1的蛋白表達水平有關。

該實驗顯示鹽酸小檗堿可以明顯改善肝臟和回腸的病理特征，并能提高回腸中Claudins、ZO-1的mRNA和蛋白表達水平。這說明鹽酸小檗堿對肝纖維化大鼠腸道黏膜屏障具有保護作用，其機制可能與其改善回腸中Claudins、ZO-1的表達有關。