DHRS2蛋白對結直腸癌細胞化療敏感性的影響

李濟民，楊 芳，袁偉奇，王 昊，羅以勤

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是臨床常見的一種消化道惡性腫瘤，在全球其致死率位居惡性腫瘤第二位[1]。目前，奧沙利鉑(oxaliplatin)作為治療結直腸癌患者的一線用藥，可以明顯改善晚期或轉移性結直腸癌患者總生存期。然而，在治療過程中，患者對奧沙利鉑的獲得性耐藥日益嚴重成為腫瘤治療失敗的主要原因[2]。因此，研究其耐藥機制已成為治療結直腸癌耐藥的關鍵因素。該研究通過體外誘導建立奧沙利鉑耐藥細胞模型，并利用串聯質譜標簽法(tandem mass tag, TMT)分析結直腸癌細胞耐藥前后蛋白表達差異。本實驗選取出表達差異顯著的短鏈脫氫還原酶超家族2 (dehydrogenase/reductase SDR family member 2, DHRS2)蛋白作為后續研究對象，利用小干擾RNA(siRNA)技術下調DHRS2的表達，研究其對結直腸癌耐藥細胞的耐藥性的影響，以期探索克服腫瘤細胞耐藥的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料人結腸癌細胞HCT116細胞株購于中國科學院上海生命科學研究院；奧沙利鉑耐藥株HCT116/OXA(用奧沙利鉑誘導產生)由本實驗室自建；CCK-8試劑購自日本同仁公司；奧沙利鉑購自美國Sigma公司；蛋白裂解液IP、5×蛋白上樣緩沖液和BCA試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司；切除修復交叉互補基因1(excision repair cross-complementation group 1,ERCC1)、DHRS2、P53和β-actin抗體均購于武漢Proteintech公司；辣根過氧化物酶(HRP)偶聯的抗兔及抗鼠IgG購于美國Jackson ImmunoResearch公司；ECL化學發光底物購自美國Thermo公司；DHRS2和P53基因干擾序列均由上海吉瑪公司設計合成。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 HCT116和HCT116/OXA細胞用RPMI-1640培養基(含雙抗)、10%胎牛血清，在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。

1.2.2CCK-8法檢測細胞存活率 取對數生長期的HCT116和HCT116/OXA細胞，消化后以1×104/ml密度接種于96孔培養板，過夜貼壁后用連續濃度奧沙利鉑處理。培養48 h后, 每孔加入10 μl CCK-8試劑,37 ℃，孵育1 h后，利用酶標儀測定450 nm處的吸光度值。每組設6個復孔，陰性對照組(NC組)加入等量的培養基，同時設置不含細胞和培養基的空白孔。據此計算細胞生存率。

1.2.3細胞轉染 取對數生長期細胞，消化后接種培養于6孔板中,待細胞匯合至60%～70%進行轉染。將siRNA溶解于Opti-MEM培養基中, 同時另取Lipofectamine 2000加入Opti-MEM培養基中, 室溫孵育5 min, 然后將兩者輕輕混合, 室溫靜置20 min。期間將6孔板細胞培養基更換為不含胎牛血清培養基，并將上述轉染混合物加入各組細胞, 置于細胞培養箱中培養。4～6 h后，將培養基更換為完全培養基繼續培養48 h，提取細胞蛋白測定轉染效率并進行后續實驗分析。

1.2.4蛋白提取和蛋白質印跡檢測 用預冷PBS清洗細胞3遍，每孔加入80 μl左右蛋白裂解液，冰上裂解15 min后，用細胞刮將細胞從6孔板底部刮離，使細胞和裂解液充分混勻。在裂解15 min后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液，即為總蛋白溶液，用BCA法測定其蛋白濃度。等質量蛋白樣品經10% SDS-PAGE電泳分離后，經300 mA、90 min濕轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h， 分別加入以1 ∶1 000稀釋的DHRS2、ERCC1、P53和β-actin抗體孵育過夜。經TBST洗滌后，加入HRP標記的特異性的羊抗兔或羊抗鼠的二抗以1 ∶5 000室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，最后用ECL化學發光試劑顯影。

1.2.5TMT定量蛋白組學 由杭州景杰生物科技有限公司完成。

1.2.5.1 TMT標記及HPLC分級 將培養的HCT116和HCT116/OXA細胞進行收集，后加入蛋白裂解液后進行超聲裂解。4 ℃、12 000 r/min離心20 min，轉移上清液至新的離心管。利用BCA法進行蛋白濃度測定。胰酶酶解的肽段用Strata X C18(Phenomenex)除鹽后真空冷凍干燥。用0.5 mol/L TEAB溶解肽段，然后根據TMT試劑盒說明標記肽段。肽段用高pH反向HPLC分級，色譜柱為Agilent 300Extend C18。

1.2.5.2 質譜分析 肽段經由超高效液相系統分離后被注入NSI離子源中進行電離然后進Q ExactiveTM質譜進行分析。離子源電壓設置為2.1 kV，肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的Orbitrap進行檢測和分析。二級質譜數據使用Maxquant (v1.5.2.8)進行檢索。

1.2.5.3 生物信息學分析 將蛋白質組學的數據進行分析處理后，以1.5倍為變化閾值 (Fold change≥1.5或≤0.67) ，P<0.05為標準。

2 結果

2.1 HCT116/OXA耐藥細胞模型驗證CCK-8檢測結果顯示，HCT116和HCT116/OXA細胞在不同濃度奧沙利鉑處理48 h后，根據公式計算得出HCT116和HCT116/OXA細胞的IC50分別為(21±1.1)μg/ml和(59±0.98)μg/ml，差異有統計學意義(t=44.68，P<0.01),見圖1A。Western blot結果表明，鉑類耐藥相關蛋白ERCC1在HCT116/OXA細胞中顯著升高(圖1B)。

圖1 HCT116/OXA耐藥細胞模型驗證

A：HCT116和HCT116/OXA對奧沙利鉑敏感性；與HCT116比較：*P<0.05,**P<0.01；B：Western blot檢測ERCC1在HCT116和HCT116/OXA中表達

2.2 蛋白質譜結果表明DHRS2在HCT116/OXA顯著升高本實驗共鑒定了5 345個蛋白質，其中4 599個蛋白質包含定量信息。本實驗以變化閾值為1.5，P<0.05為標準對鑒定出的蛋白進行了篩選，其中有64種蛋白在HCT116/OXA細胞中上調，其中紅色代表高表達，綠色代表低表達(圖2)。實驗結果表明DHRS2蛋白在耐藥細胞株HCT116/OXA顯著上升，提示其可能參與調節耐藥細胞株HCT116/OXA對奧沙利鉑的敏感性。

2.3 Western blot 驗證DHRS2蛋白上調為進一步驗證DHRS2蛋白在HCT116與HCT116/OXA細胞表達情況，實驗采用Western blot方法，結果表明DHRS2蛋白在HCT116/OXA細胞較HCT116細胞顯著升高(t=30.48，P<0.001)，見圖3。

2.4 干擾DHRS2表達后HCT116/OXA細胞對奧沙利鉑耐藥性下降為了進一步證明DHRS2的表達與結直腸癌奧沙利鉑耐藥之間的相互關系，本實驗在耐藥細胞HCT116/OXA轉染特異性siRNA，并檢測其對奧沙利鉑耐藥性變化。2條siRNA轉染HCT116/OXA后，使DHRS2表達水平分別下調至NC組(0.35±0.05)和(0.32±0.08)，差異有統計學意義(F=149.3,P<0.05)，見圖4A。同時，CCK-8結果表明,HCT116/OXA在干擾DHRS2表達后可顯著提高細胞對奧沙利鉑的敏感性，差異有統計學意見(P<0.01)，見圖4B。

圖2 HCT116/OXA細胞上調差異表達蛋白的熱圖

圖3 Western blot 驗證DHRS2在HCT116/OXA細胞表達上調A:HCT116;B:HCT116/OXA；與HCT116比較：***P<0.001

2.5 沉默DHRS2增加HCT116/OXA奧沙利鉑治療敏感性的機制Western blot結果表明，在HCT116/OXA細胞中干擾DHRS2后，P53和ERCC1表達下調(圖5A)。進一步研究顯示,在HCT116/OXA細胞中干擾P53后，ERCC1表達顯著下調(圖5B)。綜上，實驗結果表明了沉默DHRS2可通過P53依賴的方式下調ERCC1表達，從而增加HCT116/OXA細胞對奧沙利鉑的敏感性。

3 討論

結直腸癌發病率高，因早期診斷率低，患者在就診時大都處于中晚期，從而導致結直腸癌患者5年生存率僅有10%左右[1]。化療藥物耐藥的出現是結直腸癌高死亡率的一個重要原因,了解導致個體化療藥物耐藥的機制有助于確定新的藥物靶點和藥物研發,從而改善癌癥治療。奧沙利鉑作為第三代鉑類化療藥，主要是通過形成鉑-DNA復合物，破壞DNA正常結構從而抑制DNA復制和轉錄誘導腫瘤細胞凋亡[3]。研究認為DNA損傷主要是通過核苷酸切除修復途徑(nucleotide excision repair，NER)修復，ERCC1作為核苷酸切除修復途徑中的關鍵基因，在奧沙利鉑耐藥過程中起到了非常重要的作用[4]。

圖4 干擾DHRS2對耐藥株細胞HCT116/OXA化療敏感性的影響

A：DHRS2- siRNA轉染HCT116/OXA后DHRS2的表達；1：si-NC；2：si-DHRS2-1；3：si-DHRS2-2；B：干擾DHRS2的表達可提高耐藥細胞HCT116/OXA對奧沙利鉑的敏感性；與si-NC比較：*P<0.05，**P<0.01

圖5 沉默DHRS2通過P53依賴方式抑制ERCC1表達

A：Western blot檢測干擾DHRS2后P53、ERCC1表達變化；B：Western blot檢測干擾P53后，ERCC1表達情況；1：si-NC； 2：si-DHRS2-1； 3：si-DHRS2-2；4：si-NC；5：si-p53-1；6：si-p53-2

DHRS2蛋白屬于短鏈脫氫還原酶超家族(superfamily of short-chain dehydrogenases/reductases，SDR)，其基因位于人類染色體 14q11 上，編碼一種NAD/NADP依賴的氧化還原酶[5]。最近多項研究表明DHRS2參與多種腫瘤進程。例如，DHRS2在食管鱗癌中高表達，沉默DHRS2后促進食管鱗癌細胞凋亡以及抑制其遷移侵襲能力[6]。此外，在急性髓細胞白血病和胃癌中DHRS2的表達與耐藥相關[7-8]。然而，DHRS2蛋白是否參與結直腸癌細胞耐藥尚未見文獻報道。該研究利用TMT定量蛋白組學技術篩選結直腸癌耐藥細胞株HCT116/OXA與其親本HCT116蛋白表達差異，結果顯示DHRS2在耐藥株HCT116/OXA顯著上調，提示DHRS2可能參與HCT116/OXA對奧沙利鉑的耐藥。CCK-8結果表明，沉默DHRS2可增加耐藥株HCT116/OXA細胞對奧沙利鉑敏感性。

DHRS2通過和MDM2結合降低了MDM2介導的P53降解，從而穩定并活化P53[9]。P53作為一個轉錄因子，在被激活后可影響下游一系列基因表達變化。研究[10]顯示, 細胞在暴露于DNA損傷的藥物后，p53會表達上調, 表明它可能參與促進DNA修復。并有文獻[11]報道P53可通過與ERCC1啟動子結合，增強其表達從而抑制順鉑引起的DNA損傷。因此，本課題組推測沉默DHRS2是否是通過下調HCT116/OXA細胞內P53表達進而影響ERCC1的表達，從而提高耐藥株HCT116/OXA對奧沙利鉑的敏感性。為此，該實驗檢測了在HCT116/OXA細胞內干擾DHRS2后P53和ERCC1的表達。結果顯示，干擾DHRS2后，HCT116/OXA細胞內P53和ERCC1內蛋白表達水平明顯下調。且干擾P53后，ERCC1蛋白水平下調。上述結果表明，沉默DHRS2可通過P53下調ERCC1表達，從而增強耐藥株HCT116/OXA對奧沙利鉑化療敏感性。

綜上，該實驗表明DHRS2在結直腸癌耐藥細胞株HCT116/OXA上調，同時沉默DHRS2可促進奧沙利鉑的化療敏感性。初步探索其中的機制，有可能是DHRS2通過抑制P53表達從而下調ERCC1表達實現的。研究結果可為探究DHRS2影響結直腸癌惡性生物學行為提供一個新的理論依據, 為逆轉結直腸癌奧沙利鉑耐藥提供新的靶點研究策略。