IGF-1對(duì)兔脂肪干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響

朱思斌，張 雪，江 飛，許易誠(chéng)，尹宗生

傳統(tǒng)上，治療骨折創(chuàng)傷主要有手術(shù)治療和復(fù)位外固定保守治療，骨組織工程是近期提出和快速發(fā)展的新的治療手段[1]，相比舊的治療方法，骨組織工程治療過(guò)程中創(chuàng)傷的骨組織可以更快恢復(fù)，骨組織修復(fù)過(guò)程加快，骨折預(yù)后功能可以更快接近之前的水平。不同種子細(xì)胞的增殖能力和多功能分化潛力各不相同，在不同骨科疾病中的治療效果差異巨大。現(xiàn)在常用的種子細(xì)胞有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)。ADSCs于2001年第一次被發(fā)現(xiàn)，是從脂肪組織中提取的成體干細(xì)胞[2]。ADSCs起源于胚胎的中胚層，可以向多種細(xì)胞方向分化[3-4]，最終分化成成骨、成脂、成軟骨細(xì)胞。胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)是一種結(jié)構(gòu)類似于胰島素的生長(zhǎng)因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞分化、促進(jìn)骨與軟骨的合成代謝、創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中起著重要的作用[5]。研究[6]表明IGF-1可以促進(jìn) BMSCs的增殖和成骨分化。目前，ADSCs在體外培養(yǎng)下仍有生長(zhǎng)增殖較慢，成骨分化所需時(shí)間較長(zhǎng)的缺陷，為研究培養(yǎng)方法，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)在培養(yǎng)基中加入不同濃度的IGF-1，探尋IGF-1對(duì)體外培養(yǎng)下ADSCs的增殖和成骨分化能力的生物學(xué)影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6月齡SPF級(jí)健康新西蘭白兔9只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～3.0 kg，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度18～29 ℃，相對(duì)濕度達(dá)40%～70%，新鮮空氣換氣次數(shù)10次/h，氣流速度≤0.18 m/s，壓差25 Pa，潔凈度一萬(wàn)級(jí)，氨濃度15 mg/m3，噪音≤60 dB，照度150～300 Lux。

1.2 主要試劑與儀器低糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；兔脂肪干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、兔脂肪干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Cyagen公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；人重組IGF-1粉劑購(gòu)自美國(guó)R&D公司；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；CD90單克隆抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性測(cè)定試劑盒為南京建成公司產(chǎn)品。CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、超速離心機(jī)為美國(guó)Thermofisher公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡為日本Olympus公司生產(chǎn)；酶標(biāo)儀為美國(guó)BIO-TEK公司產(chǎn)品。

1.3 兔ADSCs的分離與培養(yǎng)取兔1只，戊巴比妥鈉麻醉，頸后術(shù)區(qū)剃毛備皮，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒，鋪單，在無(wú)菌手術(shù)間，沿頸后正中切口逐層切開(kāi)，分離出皮下脂肪，用添加1%含量雙抗的PBS沖洗3次，在超凈工作臺(tái)中，仔細(xì)剔除組織中的小血管，外包膜和其他組織。使用眼科剪將脂肪剪碎至乳糜狀,加入兩倍脂肪體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，攪拌均勻，將離心管放置于37 ℃水浴中振蕩消化60 min,1 200 r/min 離心 10 min，去除上層油脂、殘余脂肪組織。沉淀重懸細(xì)胞后，放入200目細(xì)胞篩過(guò)濾,濾液1 200 r/min離心5 min。使用含10%胎牛血清的低糖DMEM重懸細(xì)胞沉淀,接種至細(xì)胞瓶，放入恒溫細(xì)胞箱中培養(yǎng)，首次換液于24 h后,漂洗去除未貼壁細(xì)胞，每日鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)情況，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%左右時(shí)，用胰酶在37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化2 min左右，加入血清L-DMEM中和胰酶,設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1 200 r/min，時(shí)間5 min,將細(xì)胞離心，離心后棄去上清液，將細(xì)胞按1 ∶3傳代。

1.4 ADSCs表面抗體的檢測(cè)初代ADSCs傳代至P2，細(xì)胞在培養(yǎng)皿增殖至80%融合時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，再用含血清的低糖DMEM終止消化反應(yīng)，消化后放入離心機(jī)1 200 r/min離心5 min，棄去上清液，用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸, 調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105/ml，接種于鋪好細(xì)胞爬片的24孔板上，每孔0.5 ml。待細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定，用PBS浸洗3次，加山羊血清等待30 min。再滴加山羊抗兔CD90一抗,放入濕盒，在4 ℃環(huán)境下過(guò)夜。第2天用PBST沖洗爬片，重復(fù)3次，滴加熒光二抗，濕盒孵育1 h，PBST沖洗爬片3次。滴加DAPI，孵育5 min對(duì)ADSCs細(xì)胞核染色。染色后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 兔ADSCs向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化取P2代ADSCs，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，以每孔2 ml接種于6孔板中，2 d后，待細(xì)胞生長(zhǎng)完全融合，依照兔ADSCs成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基說(shuō)明書(shū)，使用兔成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基A液培養(yǎng)3 d，3 d后換為兔成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基B液培養(yǎng)1 d，A液和B液相互交替培養(yǎng)3～5次，每日鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待脂滴足夠大，足夠圓，用油紅O染色，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 兔ADSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化取80%融合的P2代ADSCs，加入濃度為0.25%的胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，以每孔2 ml接種于6孔板中，傳代后第2天，待細(xì)胞貼壁，換用兔成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)4周，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變后，用茜素紅染色，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 CCK-8法檢測(cè)IGF-1對(duì)ADSCs增殖活性的影響取P2代ADSCs，以2×104/cm2的密度分別接種于96孔板中培養(yǎng)，每孔加入100 μl培養(yǎng)基。依據(jù)說(shuō)明書(shū)，將重組人IGF-1粉劑溶于無(wú)菌PBS中，加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，配置成0、5、10、20 ng/ml四種濃度。設(shè)置為A組(對(duì)照組，0 ng/ml IGF-1)、B組(5 ng/ml IGF-1)、C組(10 ng/ml IGF-1)、D組(20 ng/ml IGF-1)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后加入100 μl含10% CCK-8的低糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2下反應(yīng)4 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸收值。每日重復(fù)CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次，檢測(cè)7 d。

1.8 茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)及定性分析取P2代ADSCs，以 5×104/cm2的密度分別接種于24孔板中培養(yǎng)，每孔1 ml。細(xì)胞貼壁后，換用加入IGF-1的兔成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，按每培養(yǎng)基IGF-1的濃度將24孔板設(shè)置為4組，A組(對(duì)照組，0 ng/ml IGF-1)、B組(5 ng/ml IGF-1)、C組(10 ng/ml IGF-1)、D組(20 ng/ml IGF-1)，在培養(yǎng)21 d后，每組對(duì)鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色，定性檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)。

1.9 ALP與鈣離子含量的檢測(cè)及定量分析按上述實(shí)驗(yàn)分組在24孔板中培養(yǎng)ADSCs, 在第14天和第24天時(shí)，每組取3個(gè)孔進(jìn)行鈣離子定量檢測(cè)，每孔加入1%氯化十六烷基吡啶500 μl，在常溫下反應(yīng)10 min，選擇560 nm波長(zhǎng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)鈣離子的含量。每組另外3個(gè)孔用胰酶消化后，用含血清的低糖DMEM中和反應(yīng)，離心去除殘余的胰酶，用PBS沖洗細(xì)胞兩次，加入0.1% Trizon X-100裂解細(xì)胞后收集裂解液，在高速離心機(jī)中20 000 r/min離心10 min后取上清液，依據(jù)ALP檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行ALP定量檢測(cè)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，組內(nèi)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組間比較使用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔ADSCs的形態(tài)原代培養(yǎng)后，兔ADSCs于48 h內(nèi)貼壁，原代細(xì)胞呈短梭形或小多角形，72 h后觀察，細(xì)胞增殖后密度增高時(shí)為長(zhǎng)梭形成纖維細(xì)胞樣外觀。見(jiàn)圖1A。原代培養(yǎng)7 d左右，細(xì)胞鋪滿圍繞各中心呈集落樣生長(zhǎng)。見(jiàn)圖1B。

2.2 ADSCs免疫熒光鑒定結(jié)果免疫熒光鑒定P2代脂肪干細(xì)胞，顯示結(jié)果為DAPI細(xì)胞核染色陽(yáng)性，見(jiàn)圖2A；FITC標(biāo)記的CD90染色陽(yáng)性，見(jiàn)圖2B。

圖1 倒置顯微鏡下兔脂肪干細(xì)胞的形態(tài)

A：ADSCs原代培養(yǎng)3 d，呈長(zhǎng)梭形成纖維樣外觀 ×200；B：ADSCs原代培養(yǎng)7 d，細(xì)胞鋪滿圍繞各中心呈集落樣生長(zhǎng) ×100

圖2 ADSCs免疫熒光染色 ×200

A：DAPI細(xì)胞核染色陽(yáng)性；B：FITC標(biāo)記的CD90染色陽(yáng)性

2.3 ADSCs成脂誘導(dǎo)分化結(jié)果P3代ADSCs成脂誘導(dǎo)后，培養(yǎng)皿中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得不規(guī)則，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)球形透亮脂肪滴，逐漸變大變圓，誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后，進(jìn)行油紅 O染色,染色結(jié)果為陽(yáng)性，可見(jiàn)紅色球形脂肪滴，見(jiàn)圖3A，證明ADSCs成脂分化。

2.4 ADSCs成骨誘導(dǎo)分化結(jié)果P3代ADSCs成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)由細(xì)長(zhǎng)的梭形結(jié)構(gòu)逐漸變寬大，變成不規(guī)則的多角形或多邊形。誘導(dǎo)14 d后，可見(jiàn)細(xì)胞周圍分布小褐色結(jié)節(jié)。誘導(dǎo)28 d后，形成大量鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色后可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)被染成深紅色，茜素紅染色陽(yáng)性，見(jiàn)圖3B，證明了體外培養(yǎng)的ADSCs有成骨分化的能力。

圖3 ADSCs的功能鑒定 ×100

A：ADSCs成脂分化后油紅O染色陽(yáng)性；B：ADSCs成骨分化后茜素紅染色陽(yáng)性

2.5 ADSCs的增殖活性曲線CCK-8法檢測(cè)結(jié)果：隨著培養(yǎng)基內(nèi)IGF-1濃度的增高，ADSCs增殖活性逐漸增強(qiáng)，從第2天開(kāi)始，5、10、20 ng/ml IGF-1組的增殖活性均高于對(duì)照組，其中20 ng/ml IGF-1組高于10 ng/ml IGF-1組和5 ng/ml IGF-1組，10 ng/ml IGF-1組高于5 ng/ml IGF-1組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=141.675,P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 ADSCs增殖曲線

與A組比較：*P<0.05；與B組比較：#P<0.05；與C組比較：&P<0.05

2.6 鈣離子茜素紅染色的檢測(cè)結(jié)果成骨誘導(dǎo)分化3周后，ADSCs的茜素紅染色結(jié)果為陽(yáng)性，4組細(xì)胞鏡下均可見(jiàn)紅色鈣結(jié)節(jié)。見(jiàn)圖5。在鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)密度，密度從大到小排列依次為D組、C組、B組和A組，A組密度最低。證明了IGF-1對(duì)ADSCs鈣離子的生成的促進(jìn)作用。

圖5 ADSCs鈣結(jié)節(jié)的定型鑒定 ×200

A：A組(0 ng/ml IGF-1)茜素紅染色；B：B組(5 ng/ml IGF-1)茜素紅染色；C：C組(10 ng/ml IGF-1)茜素紅染色；D：D組(20 ng/ml IGF-1)茜素紅染色

2.7 ALP和鈣離子的定量檢測(cè)ALP定量檢測(cè)： ADSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d時(shí)，D組、C組、B組中ALP活性均高于A組，且D組活性高于C組和B組，C組高于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=60.619,P<0.05)。培養(yǎng)21 d時(shí)，D組、C組、B組中ALP活性均高于A組，且D組活性高于C組和B組，C組高于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=162.816,P<0.05)，見(jiàn)圖6。鈣離子定量檢測(cè)：誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d時(shí)，D組、C組、B組的鈣離子含量均高于A組，D組高于B組，C組高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=142.931,P<0.05)，而D組和C組鈣離子含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d時(shí)，D組、C組、B組的鈣離子含量均高于A組，而且D組高于C組，D組高于B組，C組高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=71.286,P<0.05)，見(jiàn)圖7。

圖6 ALP定量檢測(cè)

與A組比較：*P<0.05；與B組比較：#P<0.05；與C組比較：&P<0.05

圖7 鈣離子定量檢測(cè)

與A組比較：*P<0.05；與B組比較：#P<0.05；與C組比較：&P<0.05

3 討論

骨科臨床上，股骨頭壞死是最常見(jiàn)的一種疾病，患病年齡多發(fā)于35～50歲，發(fā)病病因和機(jī)制非常復(fù)雜，受多種因素影響[7]，在近年的研究中，利用BMSCs等干細(xì)胞治療早期股骨頭壞死是熱門(mén)的研究對(duì)象。BMSCs可在體外培養(yǎng)，并向成骨方向和成軟骨方向分化，廣泛應(yīng)用于治療骨壞死等骨科疾病實(shí)驗(yàn)研究中[8]。但BMSCs體外培養(yǎng)需要從動(dòng)物的骨髓腔中取材，其來(lái)源少，取材困難，細(xì)胞增殖速度較慢。與BMSCs相比，ADSCs來(lái)源廣泛，取材和培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單，細(xì)胞增殖和分化速度快[9]。有研究[10]表明，在體外環(huán)境下，ADSCs的增殖能力和向成骨細(xì)胞分化潛力強(qiáng)于BMSCs，是骨組織工程中更優(yōu)秀的種子細(xì)胞。

生長(zhǎng)因子是一種活性多功能肽物質(zhì)，由特定細(xì)胞分泌，通過(guò)與靶細(xì)胞結(jié)合，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞分化。IGF-1是一種生長(zhǎng)因子，來(lái)源于體內(nèi)肝細(xì)胞、腎細(xì)胞、脾細(xì)胞等十幾種細(xì)胞自分泌和旁分泌作用于周圍組織，但大部分來(lái)自于肝細(xì)胞。受垂體分泌的生長(zhǎng)激素調(diào)控，參與調(diào)節(jié)絕大部分器官的生長(zhǎng)和功能，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化具有非常重要的作用[11-12]。骨質(zhì)疏松患者中，血清IGF-1水平下降，IGF-1可以促進(jìn)骨形成、抑制骨破壞、減少骨的吸收，對(duì)骨質(zhì)疏松具有改善作用[13]。IGF-1的結(jié)構(gòu)與胰島素相似，主要存在血液中，可以降低血糖、促進(jìn)糖異生、抑制脂肪分解、促進(jìn)組織利用葡萄糖，對(duì)糖尿病繼發(fā)骨質(zhì)疏松有著良好的治療效果。有研究[14]表明，IGF-1會(huì)影響骨細(xì)胞代謝，是骨形成和骨重建過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白，又有研究[15]表明，IGF-1可以增強(qiáng)胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白5在成骨細(xì)胞中的表達(dá)，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在培養(yǎng)基中加入不同濃度的IGF-1，觀察其對(duì)ADSCs的增殖和成骨分化的影響。本次實(shí)驗(yàn)證明，含有5～20 ng/ml IGF-1的成骨培養(yǎng)基，可以增加ADSCs的增殖活性和ALP及鈣離子含量，培養(yǎng)基中的IGF-1含量越高，ADSCs的增殖和成骨分化能力越強(qiáng)，具有劑量反應(yīng)關(guān)系，IGF-1對(duì)ADSCs的生長(zhǎng)增殖和成骨分化具有促進(jìn)作用。有研究[16]表明，IGF-1通過(guò)efn-Eph信號(hào)通路和其他多種通路作用于ADSCs，刺激ADSCs的增殖和成骨分化。本實(shí)驗(yàn)在成骨培養(yǎng)基中加入的IGF-1最大濃度為20 ng/ml，但增強(qiáng)細(xì)胞成骨分化能力的最佳IGF-1濃度仍不能確定，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。