一線抗結(jié)核藥物聯(lián)用致肝細(xì)胞炎性損傷中SIRT1的作用研究

馬 玉，張一楊，賈云鵬，徐 杰，張 咪，王 雪，吳冬雪，馮福民,2

結(jié)核病是我國(guó)較為嚴(yán)重的傳染病之一，一線抗結(jié)核藥物包括異煙肼、利福平、吡嗪酰胺等[1]，有研究[2]表明單用異煙肼對(duì)肝臟具有明顯毒副作用。單用利福平可加重肝細(xì)胞損傷，其肝毒性主要來(lái)自膽汁淤積[2]。臨床上，通常基于異煙肼，采用二聯(lián)、三聯(lián)、四聯(lián)的方式治療。目前，藥物性肝損傷機(jī)制仍不明確，有研究[3]指出，人體在代謝抗結(jié)核藥物過(guò)程中引起的炎癥反應(yīng)在肝損傷的發(fā)生過(guò)程中起重要作用，并可能成為其防治靶點(diǎn)。而沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information adjustment factor 1，SIRT1)具有抗炎、抗氧化、抗衰老等作用[4]，其可對(duì)NF-κB進(jìn)行去乙酰基作用，進(jìn)而在氧化應(yīng)激、基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝等方面發(fā)揮重要生物學(xué)功能[5]。故推測(cè)在抗結(jié)核藥物引起的肝臟炎性損傷中，SIRT1通過(guò)調(diào)控NF-κB通路發(fā)揮其抗炎作用。本研究通過(guò)模擬臨床治療結(jié)核病的方案，用三藥聯(lián)合刺激人正常肝細(xì)胞(HL-7702)，觀察肝細(xì)胞損傷過(guò)程中SIRT1的變化情況，并用SIRT1激動(dòng)劑和抑制劑干擾其表達(dá)，觀察其對(duì)NF-κB信號(hào)通路及其下游炎癥因子的影響，從而探究SIRT1在肝臟炎性損傷中的作用，為抗結(jié)核藥物性肝損傷的預(yù)防提供一定線索。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器肝細(xì)胞株HL-7702(購(gòu)自上海中科院細(xì)胞所)；異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)(日本TCI公司，批號(hào)：W3OKK-MI)；SIRT1激動(dòng)劑SRT1720和抑制劑EX527(美國(guó)Selleck公司，批號(hào)：S112906)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司，批號(hào)：AK4601)；總RNA抽提試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0020161010)；ALT、AST試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20170301)；TNF-a ELISA試劑盒和IL-6 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：201612)；CA 94089型連續(xù)光譜酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；C1000 PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)BIO-RAD公司，型號(hào)：C1000TM Thermal Cycler)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司，型號(hào)：5404CH010973)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組[6]細(xì)胞在含90% RPMI 1640、10%胎牛血清、1%雙抗混合培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)[7]。實(shí)驗(yàn)分為：C組(RPMI 1640培養(yǎng)基)、I+R+P組(含120 μg/ml異煙肼、240 μg/ml利福平、600 μg/ml吡嗪酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)基)、I+R+P+S組(含120 μg/ml異煙肼、240 μg/ml利福平、600 μg/ml吡嗪酰胺和1 μmol/L SIRT1激動(dòng)劑SRT1720的RPMI 1640培養(yǎng)基)、S組(含有1 μmol/L SIRT1激動(dòng)劑SRT1720的RPMI 1640培養(yǎng)基)、I+R+P+E組(含120 μg/ml異煙肼、240 μg/ml利福平、600 μg/ml吡嗪酰胺和1 μmol/L SIRT1抑制劑EX527的RPMI 1640培養(yǎng)基)、E組(含有1 μmol/L SIRT1抑制劑EX527的RPMI 1640培養(yǎng)基)。

1.3 HE染色檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化[7]加藥培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞后用95%乙醇固定，PBS緩沖液洗滌。蘇木精染色，1%鹽酸酒精分色，伊紅染色，在95%乙醇中調(diào)色。采用無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡檢。

1.4 細(xì)胞上清液中檢測(cè)ALT、AST水平[7]收集各組細(xì)胞上清液，在96孔板中分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和檢測(cè)孔，將ALT、AST基質(zhì)液加入各孔后，再將各組細(xì)胞上清液加入檢測(cè)孔，37 ℃溫育30 min，各孔加2，4-二硝基肼，混勻，37 ℃溫育20 min后加NaOH于各孔，混勻，室溫靜置，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中SIRT1、NF-κB p65、TNF-α、IL-6 mRNA的含量變化[7]收集各組細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，檢測(cè)其濃度及純度, OD260/OD280在1.8～2.0范圍內(nèi)用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：PrimeScript?RT Master Mix(for real time)2 μl，總RNA量為500 ng，RNase Free dH2O補(bǔ)足至10 μl，在35 ℃反應(yīng)10 min，80 ℃進(jìn)行5 s，取出反應(yīng)液即為cDNA。RT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)水平，反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ10 μl、上下游引物各0.8 μl、ROX 0.4 μl、RT反應(yīng)液2 μl、RNase Free dH2O補(bǔ)足至20 μl。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性60 s, 60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔct計(jì)算結(jié)果。引物序列見(jiàn)表1。

1.6 Western blot法檢測(cè)SIRT1、NF-κB p65蛋白的含量[8]收集各組細(xì)胞，吸出細(xì)胞上清液，加入預(yù)冷的RIPA裂解液，并將苯甲基磺酰氟(PMSF)按照100:1加到裂解液中，搖床搖約5 min后，將細(xì)胞刮進(jìn)1.5 ml EP管內(nèi)，離心10 min，取上清液進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，全程冰上操作，測(cè)定蛋白濃度，配制SDS-PAGE分離膠，各組取等量蛋白提取液，上樣后進(jìn)行垂直電泳，電泳完成后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，脫脂奶粉封閉2.5 h，加入一抗過(guò)夜，洗滌后，加入二抗孵育2.5 h，置于凝膠成像系統(tǒng)顯像，蛋白表達(dá)量為目標(biāo)蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的相對(duì)比值。

1.7 ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞中IL-6、TNF-α蛋白的含量[9]試劑盒室溫平衡20 min后取出板條，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品各50 μl，樣本孔加細(xì)胞上清液10 μl同時(shí)加入40 μl樣本稀釋液，各孔加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，封板膜封住，37 ℃溫育后，洗板5次，每孔加入顯色劑A、B，37 ℃溫育后，加終止液，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算蛋白含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理[8]采用SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，檢測(cè)方差齊性，方差齊時(shí)，組間比較采用單因素方差進(jìn)行分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)[9]，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化HE染色結(jié)果可見(jiàn)，C組、S組和E組的肝細(xì)胞形態(tài)飽滿，核大而圓，呈梭形，細(xì)胞生長(zhǎng)密集，提示激動(dòng)劑和抑制劑不影響肝細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。I+R+P組可發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞核固縮且細(xì)胞凋亡明顯，加入SIRT1激動(dòng)劑后的I+R+P+S組細(xì)胞凋亡水平降低，加入SIRT1抑制劑后的I+R+P+E組可見(jiàn)細(xì)胞凋亡水平升高，提示SIRT1激動(dòng)劑的聯(lián)用可部分減輕抗結(jié)核藥物所致肝細(xì)胞損傷，而SIRT1抑制劑的聯(lián)用可加重由一線抗結(jié)核藥物聯(lián)用引起的肝細(xì)胞損傷，見(jiàn)圖1。

圖1 不同組別肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 HE×100A：C組；B：S組；C：E組；D：I+R+P組；E：I+R+P+S組；F：I+R+P+E組

2.2 各組細(xì)胞上清液中的ALT、AST含量結(jié)果顯示：與C組相比，I+R+P組ALT、AST水平明顯升高(P<0.01)，提示抗結(jié)核藥物可誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷；S組、E組與C組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示SIRT1激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)肝細(xì)胞無(wú)毒副作用；加入SIRT1激動(dòng)劑后，ALT、AST含量降低(P<0.01)，提示抗結(jié)核藥物組中SIRT1激動(dòng)劑的加入可減緩肝損傷程度；加入SIRT1抑制劑后，則加重了肝損傷的程度，此結(jié)果均與上述HE染色結(jié)果一致。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞上清液中ALT和AST含量的變化

與C組比較：**P<0.01; 與I+R+P組比較：##P<0.01

2.3 各組細(xì)胞SIRT1、NF-κB p65、TNF-α、IL-6的mRNA及蛋白表達(dá)水平I+R+P組SIRT1的mRNA和蛋白表達(dá)量均低于C組，NF-κB p65、IL-6及TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)量均升高(P<0.01)，提示抗結(jié)核藥物可能刺激了正常肝細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。S組、E組與C組相比，IL-6、TNF-α表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示SIRT1激動(dòng)劑和抑制劑對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒副作用，與上述結(jié)果一致。與I+R+P組相比，加入SIRT1激動(dòng)劑后，NF-κB p65的mRNA及蛋白表達(dá)下降，進(jìn)而IL-6、TNF-α的mRNA及蛋白表達(dá)也下降(P<0.01)，提示SIRT1的激活可以通過(guò)降低NF-κB p65的表達(dá)進(jìn)而減輕抗結(jié)核藥物引起的肝細(xì)胞炎癥性反應(yīng)。見(jiàn)圖2和表3、4。

3 討論

目前，抗結(jié)核藥物的使用有效抑制了結(jié)核的傳播，但其副反應(yīng)卻不容小覷，其預(yù)防和治療的手段仍然有限，需要更多的研究闡明其機(jī)制。臨床上治療結(jié)核病的用藥原則是，長(zhǎng)期四種一線抗結(jié)核藥物(異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇)聯(lián)合應(yīng)用，這大大增加肝損傷的發(fā)生率，且多藥聯(lián)合應(yīng)用使得肝損傷的發(fā)生機(jī)制比單獨(dú)用藥的更加復(fù)雜，成為抗結(jié)核治療的難點(diǎn)問(wèn)題。目前關(guān)于抗結(jié)核藥物性肝損傷的發(fā)生機(jī)制研究中主要是針對(duì)一種抗結(jié)核藥物進(jìn)行闡述，在多藥聯(lián)合肝細(xì)胞模型中探究肝損傷發(fā)生機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究的特色之一就是建立異煙肼、利福平、吡嗪酰胺多藥聯(lián)合作用的肝細(xì)胞模型(因乙胺丁醇已被證明無(wú)肝毒性，故未加入模型中)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗結(jié)核藥物的聯(lián)用導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生核固縮，細(xì)胞凋亡率大幅增加，細(xì)胞上清液中ALT、AST水平也明顯升高，說(shuō)明一線抗結(jié)核藥物聯(lián)用使肝細(xì)胞發(fā)生了一定程度的損傷。

圖2 各組細(xì)胞SIRT1、NF-κB p65 蛋白表達(dá)變化

與C組比較：**P<0.01; 與I+R+P組比較：##P<0.01

表3 各組細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)mRNA的變化

與C組比較：**P<0.01; 與I+R+P組比較：##P<0.01

表4 各組細(xì)胞IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)變化

與C組比較：**P<0.01；與I+R+P組比較：##P<0.01

炎癥反應(yīng)是眾多疾病的發(fā)病基礎(chǔ)，其在肝臟疾病中尤為常見(jiàn)。研究[3]表明，抗結(jié)核藥物代謝引起的炎癥反應(yīng)在肝損傷的發(fā)生過(guò)程中起重要作用，可能成為其防治靶點(diǎn)。課題組前期研究[10]表明，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠肝細(xì)胞損傷逐漸加重，由少量炎癥細(xì)胞發(fā)展為大量聚集，提示抗結(jié)核藥物可能引起肝細(xì)胞發(fā)生炎性損傷。TNF-α作為促炎因子可促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子，而IL-6又可直接參與炎癥反應(yīng)和損傷過(guò)程。在本研究中，IL-6及TNF-α的mRNA及蛋白水平在I+R+P組中均呈高表達(dá)，而SIRT1的mRNA及蛋白表達(dá)均減少，提示I+R+P組肝細(xì)胞發(fā)生了炎癥損傷且SIRT1可能參與其中。

SIRT1作為去乙酰化酶，是一種多功能蛋白質(zhì)[11]，NF-κB作為重要的炎癥調(diào)節(jié)因子，是細(xì)胞中多個(gè)信號(hào)通路的聚集點(diǎn)，并且其高表達(dá)與肝臟疾病密切相關(guān)[12]。有研究[13]表明，SIRT1通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路從而抑制炎癥的發(fā)生。還有研究[14]顯示，SIRT1可抑制腎髓質(zhì)集合管細(xì)胞中NF-κB的轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，I+R+P組加入SIRT1激動(dòng)劑后，降低了抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)的NF-κB p65表達(dá)進(jìn)而使得細(xì)胞炎癥損傷程度減輕，相反，加入SIRT1抑制劑后，細(xì)胞炎癥損傷加重，提示激活SIRT1對(duì)藥物性肝損傷具有保護(hù)作用且與前人研究[13-14]結(jié)果相同。

目前，SIRT1在藥物性肝損傷中的機(jī)制尚不明確，有研究[15]表明，NF-κB p65可隨上游刺激物的改變而產(chǎn)生不同的修飾作用，進(jìn)而發(fā)揮其功能，其中，NF-κB p65的乙酰化修飾是其重要的修飾之一，SIRT1可通過(guò)去乙酰化作用使得腸系膜細(xì)胞中的NF-κB滅活。因此，抗結(jié)核藥物致人肝細(xì)胞炎性損傷的機(jī)制可能為，SIRT1作用于NF-κB p65，使其發(fā)生去乙酰化，減少NF-κB與炎癥因子的結(jié)合，進(jìn)而減輕了細(xì)胞炎癥損傷。

綜上，SIRT1可能參與抗結(jié)核藥物所致的肝細(xì)胞炎癥損傷過(guò)程。該研究通過(guò)模擬臨床用藥以及一系列實(shí)驗(yàn)推測(cè)SIRT1與抗結(jié)核藥物致人正常肝細(xì)胞炎癥損傷的關(guān)系，但由于細(xì)胞株單一，不能證明此推測(cè)的普遍性，應(yīng)進(jìn)一步選擇多種細(xì)胞株進(jìn)行驗(yàn)證，此外，課題組將繼續(xù)在動(dòng)物、細(xì)胞以及臨床研究等方面深入探究SIRT1在抗結(jié)核藥物所致肝細(xì)胞炎性損傷中的機(jī)制，為臨床上預(yù)防和保肝治療提供依據(jù)。