Survivin和EphA2蛋白在腦膜瘤組織中的表達及預后關系

蘇 輝，程宏偉，洪文明

在原發性腦部腫瘤中，約1/5～1/4為腦膜瘤，有部分腦膜瘤表現為惡性腫瘤特點，具有復發性、侵襲性和遠處轉移[1]。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)存活素(Survivin)可阻斷執行凋亡的蛋白裂解酶Caspases-3等，導致腫瘤細胞增殖和發展[2]，Survivin的表達與腦膜瘤的級別和復發是否相關，能否作為預測腫瘤復發和臨床預后的指標目前仍存在爭議[3]。上皮細胞激酶(epithelial cell kinase，EphA2)是血管生成擬態(vasculogenic mimicry，VM)相關的信號通路重要蛋白，有研究證實，抑制消化系統腫瘤[4]、黑色素瘤[5]細胞中Survivin、EphA2蛋白的表達可抑制VM形成。Survivin蛋白表達與腦膜瘤[6]、EphA2蛋白表達與腦膜瘤[7]的關系已有文獻報道，但有關聯合檢測凋亡抑制蛋白Survivin和VM形成中EphA2蛋白在腦膜瘤中的表達及意義文獻報道較少。該研究檢測最近4年里62例不同級別腦膜瘤患者中Survivin、EphA2蛋白的表達特點，分析其腦膜瘤預后中的價值。

1 材料與方法

1.1 病例資料62例患者為2014年2月～2018年7月均因進行性加重的頭痛等癥狀入住安徽醫科大學第一附屬醫院神經外科，且結合腦部磁共振診斷為腦膜瘤，手術后均經病理學證實。按照WHO腦膜瘤病理分級，其中34例為Ⅰ級，17例為Ⅱ級，11例為Ⅲ級；患者性別：27例為男性，35例為女性；患者年齡40～77(52.9±13.2)歲。患者均為首發病例，無其他較為嚴重的合并癥。患者對研究均知情同意，并簽署協議書。

1.2 主要試劑一抗：羊抗人Survivin多克隆抗體、羊抗人EphA2多克隆抗體購于美國Santa Cruz生物技術公司；免疫組織化學SP和DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.3 免疫組化染色及結果判斷采取免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法(streptavidin-peroxidase method,SP法)檢測Survivin、EphA2蛋白表達，步驟如下。手術切除腦膜瘤組織，4%多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，厚4 μm切片，二甲苯脫蠟，微波抗原修復，3%H2O2消除內源性過氧化物酶，羊血清封閉抗原。滴加羊抗人多克隆一抗(Survivin，1 ∶200稀釋；EphA2，1 ∶300稀釋)，4 ℃孵育過夜。次日，滴加兔抗羊二抗50 μl；DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固后鏡檢。Survivin、EphA2免疫組化結果由2名病理科醫生獨立判定，細胞質呈棕黃色或棕褐色判定為陽性細胞。按照文獻[8]方法：① 陽性染色程度計分，陰性“-”： 染色較淺，0分；弱陽性“+”：呈淺黃色，1分；陽性“”：呈黃色，2分；強陽性“”：呈棕褐色，3分。② ×200倍顯微鏡下隨機記錄500個細胞，計算陽性染色細胞占總細胞的百分比，0～10%，0分；11%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。將Survivin、EphA2蛋白的兩組數值相加以表示濃度分布評分( intensity distribution score，IDS)，IDS為0時，為陰性，將患者以IDS積分分為兩組，低表達組：0～3分；高表達組：4～7分。

1.4 Western blot檢測腦膜瘤組織中Survivin、EphA2蛋白表達隨機取手術切除腦膜瘤組織，每組5例，超低溫冰箱凍存。行蛋白免疫印跡檢查時，加入蛋白裂解液，將腦膜瘤組織研磨呈粉狀，超聲細胞破碎儀反復破碎，離心，BCA 法測定樣品蛋白濃度。行SDS-PAGE電泳，上樣量為20 μg總蛋白，加入羊抗人多克隆抗體(Survivin，1 ∶2 000稀釋；EphA2，1 ∶2 500稀釋)，4 ℃孵育過夜，次日，二抗孵育，ECL化學發光顯影，曝光，灰度分析采用Image J軟件，以GAPDH為內參，目標蛋白相對表達水平采用Survivin、EphA2蛋白和GAPDH比值表示。

2 結果

2.1 Survivin、EphA2蛋白表達與腦膜瘤一般情況比較應用濃度分布評分(IDS)比較兩種蛋白表達與腦膜瘤一般資料情況，低表達組(0～3分)與高表達組(4～7分)與患者性別、年齡、飲酒、吸煙、腫瘤部位等差異無顯著性(表1)。

2.2 Survivin和EphA2蛋白在不同病理分期腦膜瘤組織中的表達腦膜瘤臨床中主要分為Ⅰ級、Ⅱ級和Ⅲ級，Survivin、EphA2蛋白在不同級別腦膜瘤組織中的表達免疫組織化學染色結果見圖1、2。隨著病理分級水平的升高，非參數秩和檢驗相關分析顯示，Survivin和EphA2蛋白在腦膜瘤組織中升高，兩組呈正相關(F=3.627，P<0.05)，見表2。

2.3 腦膜瘤患者預后與Survivin與EphA2蛋白表達的關系術后62例腦膜瘤患者均獲得隨訪，時間為6～36(12.8±4.6)個月，統計不良預后(復發+死亡)患者病例數；本組不良預后9例(7例復發，2例死亡)，與未復發病例的Survivin IDS值(2.09±1.05)、EphA2 IDS值(2.52±1.21)比較，復發患者的Survivin IDS值(5.62±1.83)、EphA2 IDS值(5.35±1.72)，兩組之間比較差異有統計學意義(F=8.361、7.264，P<0.01)，見圖3。提示Survivin IDS值與EphA2 IDS值升高，腦膜瘤患者可能預后不良。

表1 比較Survivin和EphA2表達IDS值與腦膜瘤患者一般情況(n)

圖1 腦膜瘤組織中Survivin蛋白表達 ×400

A：腦膜瘤旁正常腦組織(-)表達；B：Ⅰ級腦膜瘤組織中(+)表達；C：Ⅱ級腦膜瘤組織中()表達；D：Ⅲ級腦膜瘤組織中()表達

圖2 腦膜瘤組織中EphA2蛋白表達 ×400

A：腦膜瘤旁正常腦組織(-)表達；B：Ⅰ級腦膜瘤組織中(+)表達；C：Ⅱ級腦膜瘤組織中()表達；D：Ⅲ級腦膜瘤組織中()表達

表2 Survivin與EphA2蛋白在不同分期腦膜瘤組織中表達

圖3 腦膜瘤患者復發情況與Survivin與EphA2蛋白表達IDS值的關系與未復發組比較：**P<0.01

2.4 蛋白免疫印跡法檢測Survivin和EphA2蛋白在不同分期腦膜瘤中的表達隨機選擇5例不同病理分級腦膜瘤組織，Western blot結果表明，Ⅰ級腦膜瘤組織中Survivin和EphA2蛋白的表達較弱，隨著病理分期升高，Survivin和EphA2蛋白的表達增強，見圖4A。由圖像分析可知，與Ⅰ級腦膜瘤組織比較，高分期的Ⅱ級和Ⅲ級腦膜瘤組織中Survivin /GAPDH和EphA2/GAPDH比值明顯升高，見圖4B。

圖4 蛋白免疫印跡檢測Survivin和EphA2蛋白在不同分期腦膜瘤組織中的表達

A：Western blot結果；B：蛋白半定量統計圖；1：Ⅰ級腦膜瘤組織；2：Ⅱ級腦膜瘤組織；3：Ⅲ級腦膜瘤組織；與Ⅰ級腦膜瘤比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

腦膜瘤早期，腫瘤往往生長緩慢，患者病情隱匿，若有典型的頭疼、癲癇等癥狀時，病情已為晚期。雖然腦膜瘤惡性程度不高，但其具有侵襲性、異常增殖、術后患者易復發的特征，且腦膜瘤組織中富含血管，常呈結節狀嵌入大腦半球中[9]。Caspases-3系具有激活半胱氨酸和裂解底物位點的蛋白裂解酶，可導致細胞凋亡，Survivin 屬于凋亡抑制蛋白家族，功能多樣，參與細胞凋亡、分裂和老化，Survivin可阻斷Caspases-3蛋白裂解酶，抑制腫瘤細胞凋亡[10]。研究[11]表明，高表達Survivin提示腫瘤患者預后不良或藥物抵抗，而抑制腫瘤細胞中Survivin表達可抑制腫瘤增殖，誘導腫瘤凋亡。由此提示Survivin在腦膜瘤細胞增殖和信號轉導通路中發揮功能。

近年來的研究[12]表明，腫瘤細胞的生長中常出現VM，中胚層的血管間葉組織代替內胚層起源的上皮細胞，形成腫瘤細胞上皮-間質轉化。腫瘤細胞的血管生成擬態是指腫瘤細胞圍成條管道樣結構，可以模擬血管作用，但沒有血管內皮細胞形成，在這些無內皮細胞管道樣結構中，血液可以在其中流動，從而供給腫瘤組織營養，故抗新生血管的分子靶向治療成為近年來抗腫瘤藥物研發的一個重要課題。實體瘤腦膜瘤的生長過程需要豐富的血供，血管為其生長和侵襲提供充足的營養和氧，對腦膜瘤血管新生機制的研究有望成為有效的減少腦膜瘤復發和分子靶向治療的依據。研究[13]表明，上皮細胞激酶(EphA2)是VM相關的信號通路蛋白，作為受體蛋白酪氨酸激酶，EphA2在血管生成方面起重要的調節作用，抑制EphA2的表達，在臨床治療胰腺癌中已取得一定的療效。本研究應用免疫組織化學和蛋白免疫印跡法均證實EphA2在高級別的腦膜瘤中表達更為明顯，與腦膜瘤的復發呈正相關。

該研究由于病例數，尤其是Ⅱ級和Ⅲ級腦膜瘤較少，在分析中可能會存在偏倚；同時，隨訪時間不夠，有待進一步收集病例和延長隨訪時間。總之，調控細胞增殖和凋亡的關鍵蛋白Survivin以及VM相關蛋白EphA2在惡性程度較高的Ⅲ級腦膜瘤中高表達，兩者聯合檢測可作為腫瘤治療的理想靶點。同時，該研究發現Survivin和EphA2蛋白的表達水平與腦膜瘤患者的預后有關，故兩者的深入研究為精準治療腦膜瘤的提供新的可能，值得進一步研究。