冠心病相關細胞凋亡及中藥抗凋亡機制的研究進展

董 艷，劉詠梅，王 階

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)以冠狀動脈粥樣硬化為基礎病理改變，其發生發展與炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡等密切相關。其中，細胞凋亡是導致心臟或血管結構改變和功能失調的重要原因，而心肌細胞、血管內皮細胞、血管平滑肌細胞和巨噬細胞等的凋亡扮演著十分重要的角色。當這些細胞凋亡超出機體自身的調節能力，凋亡與增殖出現失衡，就會誘發冠狀動脈粥樣硬化和心肌損傷。目前，已有不少研究發現中藥能通過調節冠心病相關細胞凋亡，發揮抗心肌缺血和缺血再灌注(I/R)損傷的作用。因此，有必要對冠心病發生發展過程中不同類型細胞的凋亡，以及中藥干預這些細胞凋亡的作用機制進行梳理，以明確中藥防治冠心病的分子機制，揭示其微觀病理層面的藥效，為提高臨床療效提供理論依據。

1 細胞凋亡的生物過程

細胞凋亡即細胞程序性死亡，是由基因調控的一種細胞自主有序的死亡，對機體維持細胞內環境穩定和正常生理功能具有十分重要的意義。但是，細胞凋亡是一把雙刃劍，當出現過度凋亡，超出機體自身調節的范圍時，亦會產生一系列的病理改變。經典的細胞凋亡途徑包括線粒體途徑(內源途徑)和死亡受體途徑(外源途徑)。線粒體是調控凋亡信號轉導的重要細胞器[1]，多種凋亡信號或上游通路被激活后能誘導線粒體發生形態或功能改變，膜電位降低，通透性增加，釋放出促凋亡因子細胞色素c(Cyt c)，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)級聯反應[2]，從而促進細胞凋亡。而死亡受體凋亡通路由自殺相關因子(Fas)/ Fas配體(FasL)、腫瘤壞死因子(TNF)/TNF受體1(TNFR1)和TNF相關凋亡誘導配體(TRAIL)/TRAIL受體2(TRAILR2)等死亡受體/配體介導，其中Fas是一種Ⅰ型跨膜蛋白，為凋亡信號轉導的啟動子，與配體FasL結合后，激活Caspase級聯反應[3]。此外，近年來有學者報道內質網應激(ERS)亦能促進細胞凋亡。當內質網受到持續而劇烈的損傷時，ERS觸發的蛋白激酶受體樣內質網激酶(PERK)、肌醇需要酶1(IRE1)和轉錄激活因子6(ATF6)3條促生存通路轉變為C/EBP同源蛋白(CHOP)/生長阻滯和DNA損傷誘導基因153(GADD153)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶12(Caspase12) 凋亡信號通路[4-5]。CHOP 基因被大量激活，能誘發下游死亡受體或線粒體凋亡途徑[6-8]，促進細胞凋亡。因此，ERS介導的凋亡可被認為是細胞凋亡的第3條途徑。

在以上細胞凋亡的過程中，凋亡調節因子B細胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Caspase家族受多種信號通路調節，參與了細胞凋亡的關鍵步驟。其中，Bcl-2和Bcl-2相關X蛋白(Bax)是細胞凋亡過程中具有相反作用的調節因子，主要參與線粒體凋亡途徑；Bcl-2抑制細胞凋亡，Bax則促進細胞凋亡。Caspase為半胱天冬蛋白酶，是細胞凋亡過程中的關鍵調節因子[9]，在死亡受體凋亡途徑、線粒體凋亡途徑和ERS凋亡途徑中發揮著不可替代的作用。

2 冠心病相關細胞凋亡

冠心病的發生發展與血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞以及心肌細胞等的凋亡失衡密切相關，且冠狀動脈病變的嚴重程度與細胞凋亡呈正相關[10]。其中，內皮損傷和細胞凋亡是始動因素；血管平滑肌細胞過度增殖和遷移、巨噬細胞凋亡是發展因素；心肌細胞凋亡則是心肌缺血缺氧損傷的表現。

2.1 血管內皮細胞凋亡增加 血管內皮細胞是構成冠狀動脈內壁的主要細胞，具有吞噬和分泌功能，參與冠狀動脈和心臟的多種生理和病理過程。臨床上，多種原因誘導的血管內皮細胞損傷是觸發冠狀動脈粥樣硬化形成的首動因素；同時，內皮細胞過度凋亡能誘導斑塊侵蝕，內膜下膠原直接與血流接觸，從而增加非斑塊破裂性血栓事件的風險[11]。研究顯示，冠心病血瘀證病人存在凋亡相關轉錄因子Bcl-2的差異表達[12]。而對于早發冠心病病人，其血管內皮細胞凋亡數目明顯增加，可能與高密度脂蛋白(HDL)含量降低有關；進一步實驗證實，低水平HDL能升高活性氧(ROS)含量，激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)活性，進而促進人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)凋亡[13]。而在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的血管內皮損傷中，下調的張力蛋白同源基因(PTEN)和激活的信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)信號通路介導了細胞增殖抑制和凋亡促進過程[14]。此外，亦有學者報道，血管內皮細胞的凋亡受非編碼RNA調控。miR-124和miR-22均為血管內皮細胞保護因子，其中miR-124在冠心病病人血漿中低表達，能通過降低cleaved Caspase-3水平，升高Bcl-2表達，進而發揮抗HUVECs凋亡和促進HUVECs增殖的作用[15]；而miR-22則靶向下調人隱熱蛋白(NLRP3)基因，抑制冠心病大鼠心肌微血管內皮細胞凋亡，并降低促炎性因子的表達[16]。另有研究發現，長鏈非編碼RNA(lncRNA)牛磺酸上調基因1(TUG1)在冠心病病人中表達上調，當敲低lncRNA TUG1表達時，內皮細胞凋亡數目減少，且白細胞介素-8(IL-8)含量降低，表明lncRNA TUG1通過調節細胞凋亡和炎性因子，參與冠心病的發生發展[17]。

2.2 血管平滑肌細胞和巨噬細胞凋亡失衡 血管平滑肌細胞構成冠狀動脈血管壁的肌層部分，在冠狀動脈粥樣硬化的病理狀態下，平滑肌細胞增生，合成并分泌膠原纖維蛋白，促進管腔狹窄和管壁硬化。巨噬細胞為具有吞噬作用的免疫調節細胞，吞噬低密度脂蛋白后形成泡沫細胞，促進脂質斑塊的形成。研究發現，死亡受體5(DR5)及其配體TRAIL主要表達于平滑肌細胞和巨噬細胞中，其濃度越高，冠狀動脈病變的程度越重[18]。而在冠狀動脈粥樣硬化組織中，Bax、死亡相關蛋白激酶(DAPK)和瞬時受體電位通道5(TRPC5)等凋亡相關基因表達異常是造成細胞凋亡失衡的重要原因[19-20]。其中，TRPC5出現異常高表達，當降低TRPC5水平時，ox-LDL誘導的巨噬細胞增殖抑制和凋亡促進作用被抑制，其潛在的調節機制為減少Caspase-3表達和激活蛋白激酶B(Akt)信號通路[20]。由此可見，死亡受體介導的凋亡是血管平滑肌細胞和巨噬細胞異常凋亡的主要途徑。

2.3 心肌細胞凋亡增加 心肌細胞是心臟發揮正常舒縮功能和電活動的載體，其細胞凋亡參與心肌缺血缺氧損傷的病理過程。研究發現，在冠心病猝死早期或輕度缺血狀態下，細胞凋亡可能為心肌細胞死亡的主要方式，其受Bax和Bcl-2蛋白表達的影響[21]。當Bax/Bcl-2表達失衡時，線粒體途徑被激活，促進了心肌細胞凋亡[22]。另有研究報道，心肌缺氧能通過促進Rho相關蛋白激酶1(ROCK1)和Rho相關蛋白激酶2(ROCK2)基因表達，進而激活Caspase-3和磷酸化磷脂酰肌醇-3-羥激酶(p-PI3K)介導的凋亡途徑。當ROCK1和ROCK2表達沉默時，由缺氧誘導的大鼠心肌細胞增殖減弱及凋亡增強得到一定改善[23]。同時，在冠心病猝死心肌組織中，程序性細胞死亡因子4(PDCD4)表達上調能促使細胞過度凋亡，細胞間連接過度破壞和端粒酶表達增強[24]。此外，冠心病病人冬眠心肌細胞凋亡數目增加，并與p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)蛋白[25]與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)mRNA[26]表達呈正相關。因此，心肌缺血缺氧能誘導多種凋亡相關因子和炎性因子表達，從而促進心肌細胞出現異常凋亡。

3 中藥調節冠心病細胞凋亡作用機制

許多中藥復方或活性成分能通過激活或抑制線粒體、死亡受體或ERS的3條凋亡途徑，同時調節細胞凋亡相關因子、信號通路或靶基因，參與血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞和心肌細胞等的凋亡過程，從而在冠心病的防治中發揮越來越重要的作用。

3.1 調節3條細胞凋亡途徑 線粒體、死亡受體和ERS介導的凋亡是細胞凋亡的3條主要途徑。其中，線粒體能接受不同凋亡刺激，在促凋亡和抗凋亡過程中發揮著關鍵的作用；而血清可溶性Fas(sFas)能激活死亡受體凋亡途徑，其表達上調與冠心病相關[27]；ERS凋亡途徑則作為一種新的凋亡激活方式，在中藥抗凋亡過程中發揮著越來越重要的作用。研究顯示，龍牙楤木總皂苷通過開放線粒體ATP敏感性鉀通道(mitoKATP)，穩定線粒體膜電位，降低膜通透性，減輕鈣超載，抑制氧化應激反應和心肌細胞凋亡，從而改善能量代謝，抗心肌I/R損傷。同時，該心肌保護作用能被mitoKATP抑制劑5-羥基奎酸鹽(5-HD)所逆轉，表明mitoKATP很可能是龍牙楤木總皂苷抑制心肌細胞凋亡的作用靶點[28-29]。而丹參酮ⅡA(Tan ⅡA)則能升高線粒體膜電位，抑制線粒體中凋亡誘導因子(AIF)的核轉移和脫氧核糖核酸(DNA)片段化，并降低ROS含量，從而發揮抗內皮細胞凋亡的作用[30]。

對于死亡受體凋亡途徑，有研究顯示，大黃素能上調Fas的mRNA 表達，激活細胞凋亡，抑制兔主動脈平滑肌細胞增殖[31]。而益氣通脈口服液、參烏冠心顆粒可通過下調Fas和Bax表達，升高Bcl-2，減少Caspase-3含量，進而同時調節死亡受體和線粒體途徑，發揮抗大鼠I/R損傷和缺血心肌細胞凋亡的作用[32-33]。此外，有學者報道心肌細胞內鈣超載能激活凋亡相關基因，誘導I/R損傷，且心肌細胞凋亡程度與細胞內鈣離子濃度呈正比[34-35]。而川芎嗪能通過減輕I/R心肌細胞的鈣超載，降低Fas蛋白表達，從而抑制死亡受體介導的細胞凋亡[36-37]。同樣，通過調控細胞膜鈣離子通道，降低胞內Ca2+超載，人參皂苷Rb1[38]、牛磺酸[39]和粉防己堿[40]等表現出抑制心肌細胞凋亡和抗I/R損傷的保護作用。有關ERS凋亡途徑，有研究發現，黃連素能抑制胞外信號調節激酶(ERK)-鈣激活中性蛋白酶2(Calpain2)信號通路，進而對抗ERS誘導的心肌細胞凋亡[41]。相反，對于異常增殖的血管平滑肌細胞，TanⅡA和丹參通脈方能通過激活ERS誘導細胞凋亡。其潛在的作用機制為TanⅡA促進ERS標志性免疫球蛋白結合蛋白(BIP)的基因上調，放大ERS信號[42]。而丹參通脈方亦可促進BIP的基因及蛋白表達，同時上調CHOP，進而促進血管平滑肌細胞凋亡，發揮抗動脈粥樣硬化的作用[43]。

3.2 調節細胞凋亡相關因子 Bcl-2和Caspase家族是細胞凋亡的關鍵調控因子，同時也是中藥干預的重要靶點。不少中藥活性提取物、中藥復方和中成藥，包括苯甲酰芍藥甙[44]、菟絲子總黃酮[45]、葛根素[46]、茯苓杏仁甘草湯合橘枳姜湯[47]、二參湯[48]、復方三七顆粒[49]、枳桂舒心顆粒[50]、活血膠囊[51]和參紅通絡顆粒[52]等，能通過上調Bcl-2，下調Bax蛋白表達，升高Bcl-2/Bax比值，抑制心肌、血管平滑肌細胞凋亡，從而發揮抗心肌缺血和抗冠狀動脈粥樣硬化的作用。此外，瓜蔞薤白半夏湯合血府逐瘀湯[53]、加味溫膽方[54]、當歸補血湯[55]和冠心平[56]等不僅能調節Bcl-2和Bax平衡，還能降低心肌細胞、血管內皮細胞中Caspase-3、Caspase-9和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8(Caspase-8)的表達水平，發揮抗凋亡作用。值得注意的是，人參皂苷Re能抑制Bcl-2，并升高Caspase和Bax表達，促進血管平滑肌細胞凋亡，表現出抗球囊損傷和內膜增生的作用[57]。由此可見，通過調控Bcl-2、Bax和Caspase等表達，中藥發揮明顯的抗心肌內皮細胞凋亡，協調平滑肌細胞凋亡失衡，進而防治冠心病的作用。

3.3 調節細胞凋亡相關信號通路 目前有關中藥抗凋亡相關的信號通路主要包括磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)-Akt 和p38 MAPK通路。其中，PI3K-Akt信號通路能直接抑制凋亡促進因子Bcl-2相關死亡促進因子(Bad)、Bax和Caspase-9等活性[58-59]；或上調叉頭轉錄因子(Forkhead)[60]和核因子-κB (NF-κB)[61]，促進p53失活或降解[62-63]，間接調節凋亡相關蛋白，從而發揮多途徑抗細胞凋亡的作用。相反，p38 MAPK信號通路則促進細胞凋亡，其作用機制可能與增強原癌基因(c-myc)和TNF表達[64-65]，磷酸化p53(p-p53)[66]，調節Fas/FasL表達[67]，并誘導Bax轉位[68]相關。研究發現，Tan ⅡA能上調PI3K-Akt信號通路，抑制心肌細胞凋亡，并降低炎癥反應，從而縮小糖尿病大鼠I/R的心肌梗死面積，改善心功能[69]。而丹皮酚則通過抑制p38 MAPK信號通路，降低TNF-α、p-p53和cleaved Caspase-3蛋白水平，改善血管平滑肌細胞凋亡[70]。此外，大蒜素可以下調 p53蛋白表達，參與巨噬細胞、血管平滑肌細胞的凋亡過程，縮小斑塊面積，并穩定易損斑塊[71]。

3.4 調節ncRNA表達及功能 ncRNA是一類具有基因調節功能的非蛋白編碼RNA，主要包括miRNA、lncRNA及circRNA等，能直接或間接調控mRNA的表達，進而參與下游細胞凋亡相關通路。中藥活性提取物被證實能通過靶向調節miRNA或lncRNA表達，發揮調控血管內皮細胞或平滑肌細胞凋亡的作用。研究顯示，三七總皂苷能改善過氧化氫(H2O2)誘導的HUVECs凋亡，潛在的機制為下調hsa-miR-146b-5p表達[72]。而黃芩素和川芎嗪則分別通過調節lncRNA和miRNA促進異常增殖的血管平滑肌細胞凋亡。其中，黃芩素上調lncRNA AK021954，并降低成纖維細胞生長因子18(FGF18)表達，從而以劑量依賴方式抑制血管平滑肌細胞增殖并促進凋亡[73]。川芎嗪下調miRNA-21、miRNA-221和miRNA-223，同時上調miRNA-143和miRNA-145表達，進而抑制鈣調蛋白依賴性激酶Ⅱδ(CaMKⅡδ)，并促進鈣調蛋白激酶ⅡN(CaMKⅡN)表達，表現出抗平滑肌細胞增殖和遷移，促進細胞凋亡，抑制血管重塑的功能[74]。

3.5 其他作用機制 ox-LDL和血同型半胱氨酸(Hcy)均為促進動脈粥樣硬化發生發展的重要危險因素。其中Hcy具有促進平滑肌細胞增殖和誘導動脈粥樣硬化的作用[75]，且該作用可能由ERS介導的細胞凋亡調控[76]。相反，高Hcy血癥亦能激活ERS反應，從而促進動脈粥樣硬化進展[77]。中藥通過降低ox-LDL、Hcy水平，發揮抑制心肌細胞、血管內皮細胞凋亡，或促進異常增殖的平滑肌細胞凋亡的作用。丹酚酸B能抑制ox-LDL誘導的HUVECs凋亡，且該內皮保護作用在一定范圍內呈量效關系[78]。淫羊藿苷和姜黃素則能對抗ox-LDL誘導的血管平滑肌細胞增殖并促進其凋亡[79]。其中，姜黃素通過抑制ox-LDL誘導的血管平滑肌細胞單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)和單核細胞趨化蛋白(MCP)的mRNA表達，發揮細胞增殖抑制和凋亡促進作用[80]。另有研究顯示，淫羊藿苷還能促進葡萄糖調節蛋白78(GRP78)mRNA表達，激活Caspase3酶活性，抑制Hcy誘導的血管平滑肌細胞增殖并促進其凋亡[75，81]。銀杏葉膠囊則通過降低Hcy水平，下調Bax、即刻早期基因(c-Fos)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)基因表達，抑制血管內皮細胞凋亡[82]。桃紅四物湯可降低高Hcy血癥模型大鼠TNF-α的mRNA及蛋白水平，抑制cleaved Caspase3表達，并具有下調Fas mRNA的趨勢，從而發揮抗死亡受體凋亡途徑的潛能[83]。苦碟子和葛根通脈飲亦可促進Hcy誘導增殖的平滑肌細胞凋亡，進而發揮抗動脈粥樣硬化的作用[84-85]。

據報道，某些中藥參與調節細胞凋亡，但具體抗凋亡機制尚未完全闡述。例如，溫心膠囊[86]、參麥注射液[87]、補陽還五湯[88]、落新婦苷[89]和冠心伏寒顆粒[90]等均能減少心肌細胞凋亡。而人參皂苷Rb1[91]和榅桲提取物[92]則抑制I/R或H2O2誘導的血管內皮細胞凋亡；冠通方[93]和紅花[94]對異常增殖的血管平滑肌細胞具有明顯的促凋亡作用。值得注意的是，通心絡膠囊不僅能改善I/R大鼠模型的心肌細胞凋亡[95]；同時，通過抑制巨噬細胞向M1型極化，通心絡還能降低血管內皮細胞凋亡率，進而發揮內皮保護功能[96]。

4 結 語

細胞凋亡失衡普遍存在于冠心病病人的血管內皮細胞、血管平滑肌細胞、巨噬細胞和心肌細胞中。作為疾病的重要促進因素，細胞凋亡同時也是藥物發揮治療作用的重要調控途徑。許多中藥復方或提取物能通過調控線粒體、死亡受體或ERS凋亡途徑，或調節細胞凋亡途徑中的關鍵因子、通路或靶基因等，發揮顯著的心肌或血管保護作用。通過揭示中藥的抗凋亡作用，不僅有助于明確其防治冠心病的分子機制，并揭示其微觀病理層面的藥效，提高臨床療效；更能從改善血管或心肌細胞存活方面進一步促進冠心病中藥新藥的研發。但是，目前的研究大多為中藥復方制劑，藥味較多、藥量不定且成分復雜，因此，精確中藥發揮藥效的具體成分或成分組合，是今后在中藥抗凋亡和防治冠心病領域亟待解決的問題。