柴胡皂苷D對H2O2誘導(dǎo)大鼠心肌細胞H9c2損傷保護機制研究

丁雨 陳雪梅 吳思思

在心血管疾病的發(fā)生中，活性氧自由基增多導(dǎo)致的細胞凋亡與各類心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如心肌梗死、冠心病、高血壓、動脈粥樣硬化等[1-5]。另外心血管疾病的治療方式，如心臟外科體外循環(huán)、心肺腦復(fù)蘇等的建立，雖為患者解決了病患，但再灌注損傷并發(fā)癥仍會影響患者愈后，而氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致的氧自由基增多是心肌缺血再灌注引起損傷發(fā)生的重要病理基礎(chǔ)[6]。所以降低氧化應(yīng)激反應(yīng)水平，避免細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生，對心肌損傷具有保護作用[7-11]。柴胡皂苷為柴胡的主要活性成分，研究者利用現(xiàn)代萃取工藝對柴胡進行分離提純，已存在柴胡皂苷A、B、C、D等150多種[12]。隨著中醫(yī)的發(fā)展，中藥成分研究的不斷深入，柴胡皂苷的作用及其機制的研究也越來越廣泛，大量文獻報道柴胡皂苷除了抗抑郁、解毒保肝等傳統(tǒng)中醫(yī)治療作用外[13-15]，還能通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[16]、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化為正常細胞[17-18]、抑制腫瘤血管產(chǎn)生[19]、抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲[9，20-21]等產(chǎn)生抗腫瘤作用。但是柴胡皂苷對心肌功能的作用研究鮮有報道，本文旨在探討柴胡皂苷D對心肌損傷是否具有保護作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 大鼠心肌細胞（H9c2）由本中心保存；柴胡皂苷D購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司；2，7-雙乙酸二氯熒光素（DCFH-DA）購自美國Sigma公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；凋亡檢測試劑盒購自北京四正柏生物技術(shù)有限公司；Hoechst染液購自美國Sigma公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒購自美國Promega公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；CCK-8檢測試劑購自日本同仁化學(xué)研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液購自美國HyClone公司；細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶及凍存管等購自美國Corning公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。本研究所用儀器如下：Synergy Mx多功能熒光酶標儀為美國Bio-Tek公司產(chǎn)品；Cytoflex流式細胞儀為美國 Beckman Coulter公司產(chǎn)品；Connect Real-time PCR儀為美國BIORAD公司產(chǎn)品；Integral 10純水儀為美國Millipore公司產(chǎn)品；二級生物安全柜、三氣培養(yǎng)箱為美國Thermo公司產(chǎn)品；SX-700高壓滅菌鍋為中國TOMY公司產(chǎn)品；CO2培養(yǎng)箱為德國Binder公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 H9c2大鼠心肌細胞培養(yǎng) 使用 Low Glucose DMEM（含10%FBS）培養(yǎng)H9c2細胞，環(huán)境條件為37℃、5%CO2，每2d換液一次。當細胞融合率達到85%～90%，用含EDTA的0.25%胰酶消化H9c2細胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度至1×105個/ml，分別接種到 96 孔板、12 孔板中，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。

1.2.2 建立H2O2誘導(dǎo)心肌細胞氧化損傷模型 當細胞融合率達到85%～90%，用含EDTA的0.25%胰酶消化H9c2細胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，用培養(yǎng)基重懸，接種至24孔板中培養(yǎng)，每孔1×105個細胞。培養(yǎng)24h后，將H2O2稀釋至終濃度為400μM，再分別作用4h，利用Hoechst 33258染色觀察細胞凋亡情況。正常細胞形態(tài)完整，核染色均勻；凋亡細胞則表現(xiàn)為細胞核固縮突亮或者碎塊狀致密濃染。

1.2.3 柴胡皂苷D處理后細胞凋亡情況觀察 將細胞懸液接種至12孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，實驗分別設(shè)置對照組、H2O2誘導(dǎo)心肌損傷模型組（簡稱模型組）、預(yù)先用柴胡皂苷 D（濃度分別用 1μM、4μM、16μM）預(yù)處理 3h再加入 400μM H2O2處理4h的實驗組（分別簡稱1μM實驗組、4μM實驗組、16μM實驗組）。PBS清洗3次，然后 37℃條件下 Hoechst 33258（1mg/L）孵育 10 min，再次PBS清洗3次，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 柴胡皂苷D處理后細胞凋亡情況檢測 將細胞懸液接種至12孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，實驗分別設(shè)置對照組、H2O2誘導(dǎo)心肌損傷模型組（簡稱模型組）、用4μM的柴胡皂苷D預(yù)處理3h后再加入400μM H2O2處理4h的實驗組（簡稱4μM實驗組）。用含EDTA的0.25%胰酶消化H9c2細胞，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，PBS洗2次，去除EDTA的干擾，用四正柏Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑進行孵育，再利用流式細胞儀完成凋亡檢測。

1.2.5 細胞內(nèi)ROS檢測 將細胞懸液接種至黑色不透光24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h，按照1.3.4中實驗方法處理細胞，H2O2處理后棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗2次，分別加入用Low Glucose DMEM（無FBS）稀釋的終濃度為10μM的DCFH-DA。置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育20 min。孵育完成后，用PBS洗滌細胞3次，以充分除去未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA，防止液體本底熒光強度過高。將24孔板置于Synergy Mx多功能熒光酶標儀上，設(shè)置參數(shù)直接檢測孔板中H9c2細胞內(nèi)的熒光強度。冰上，將檢測完的細胞用RIPA緩沖液裂解細胞30min，13 000 r/min離心15 min，收集上清液。用BCA法檢測總蛋白含量，熒光值/蛋白質(zhì)量（AFU/μg）使結(jié)果標準化。

1.2.6 LDH、MDA含量測定 將細胞懸液接種至24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，按照1.3.4中實驗方法處理細胞，收集細胞上清檢測LDH含量，細胞用RIPA緩沖液裂解細胞30min，13 000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA法檢測總蛋白含量，然后利用檢測試劑盒測定MDA含量。

1.2.7 過氧化物酶體增殖子活化受體（peroxisome proliferator-activated receptors,PPARγ）、核因子 E2相關(guān)因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）基因水平的表達情況檢測 將細胞懸液接種至24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24h后，按照1.3.4中實驗方法處理細胞，收集細胞用試劑盒提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模版進行Real-time PCR檢測。逆轉(zhuǎn)錄條件:42°C 15min，85℃5s，12℃ 20min，PCR 擴增條件:94℃ 2min，94℃ 10s，60℃ 30s，40個循環(huán)。引物序列見表1。

表1 Real-time PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graphad prism 6.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用One-way ANOVA Tukey's檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H9c2大鼠心肌細胞氧化損傷模型建立及各組細胞凋亡情況檢測 見插頁圖1及圖2。

由插頁圖1可見，與對照組相比，模型組大量H9c2心肌細胞出現(xiàn)細胞核濃染、細胞體積縮小、部分核破裂的凋亡表現(xiàn)，表明心肌細胞氧化損傷模型成功建立。與模型組相比，1μM、4μM、16μM 實驗組的凋亡細胞減少。由圖 2 可見，與對照組（11.72%±1.84%）相比，模型組的細胞凋亡率（16.99%±2.14%）顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，4μM 實驗組的凋亡率（9.17%±2.07%）下降（P＜0.05）。

2.2 細胞內(nèi)ROS含量檢測結(jié)果 見圖3。

由圖3可見，與對照組[（17.28±1.66）FU/μg]相比，模型組ROS含量[（36.15±2.31）FU/μg]升高（P＜0.05）；而與模型組相比，4μM實驗組ROS含量[（23.25±1.313）FU/μg]下降（P＜0.05）。

2.3 細胞內(nèi)LDH、MDA含量檢測結(jié)果 見圖4。

圖2 各組H9c2心肌細胞流式細胞儀檢測結(jié)果（與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05）

圖3 細胞內(nèi)ROS含量檢測結(jié)果（與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05）

圖4 細胞內(nèi)LDH、MDA含量檢測結(jié)果（與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05）

由圖 4 可見，與對照組［（149.7±4.3）U/L］比較，模型組 LDH 含量［（252.9±2.1）U/L］升高（P＜0.05）,而與模型組相比，4μM 實驗組的 LDH 含量［（201.7±7.2）U/L］下降（P＜0.05）；與對照組［（1.60±0.30）nmol/mg］比較，模型組的 MDA 含量［（5.28±0.14）nmol/mg］升高（P＜0.05），而與模型組比較，4μM 實驗組的 MDA 含量 ［（2.60±0.41）nmol/mg］下降（P＜0.05）。

2.4 Nrf2、HO-1 和 PPARγ mRNA 水平表達情況的檢測結(jié)果 見圖5。

圖5 Nrf2、HO-1和PPARγmRNA水平表達情況的檢測結(jié)果（與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05）

由圖 5 可見，與模型組（1.68±0.06）比較，4μM 實驗組 Nrf2 的 mRNA 表達（2.18±0.16）增加（P＜0.05）；與模型組（1.47±0.06）比較，4μM 實驗組 HO-1 的 mRNA 表達（1.79±0.18）增加（P＜0.05）；與模型組（0.90±0.11）比較，4μM 實驗組 PPARγ 的 mRNA 表達（1.47±0.18）增加（P＜0.05）。

3 討論

很多研究報道氧化應(yīng)激反應(yīng)是引起心肌損傷的主要病理原因，在心肌缺血再灌注的過程中產(chǎn)生的大量ROS、氧化損傷DNA、蛋白質(zhì)、脂類等，造成細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)、功能的破壞，從而導(dǎo)致心肌細胞凋亡[9]。H2O2是一個重要氧化反應(yīng)分子，參與很多重要胞內(nèi)反應(yīng)，如轉(zhuǎn)錄因子激活、基因表達、細胞增殖，但是過量的H2O2會增強胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷胞內(nèi)的各種分子而導(dǎo)致心肌細胞凋亡[9，22]。

為了確定柴胡皂苷是否具有抗氧化保護作用，本文參考文獻[22-23]采用適量的H2O2（400μM）誘導(dǎo)體外心肌損傷模型。心肌損傷模型成功建立后，加入柴胡皂苷D，Hoechst 33258染色及流式細胞凋亡檢測結(jié)果顯示柴胡皂苷D處理后凋亡細胞量較模型組明顯降低，表明柴胡皂苷D可能對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞損傷具有保護作用。細胞內(nèi)大量氧自由基的存在，會造成膜上不飽和脂肪酸過氧化作用，從而引起細胞損傷，MDA就是過氧化物產(chǎn)物之一，而細胞膜的損傷也會使原本穩(wěn)定存在胞內(nèi)的LDH釋放出來，因此檢測LDH、MDA含量可表明細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)程度[24]。本實驗結(jié)果顯示，柴胡皂苷處理后細胞ROS、LDH、MDA含量明顯降低,說明柴胡皂苷D能夠降低H2O2引起的心肌細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

Nrf2是一種普遍存在的多效性轉(zhuǎn)錄因子，是細胞內(nèi)應(yīng)激的主要基因組穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)因子，對哺乳動物細胞內(nèi)氧化還原平衡和保護性的抗氧化反應(yīng)起調(diào)節(jié)作用[25-27]。HO-1是Nrf2調(diào)控的基因之一，主要起到抗氧化防御力，當氧化應(yīng)激發(fā)生時，Nrf2入核啟動抗氧化物酶HO-1的表達，增強機體抗氧化應(yīng)激的反應(yīng)能力[28]。已有大量研究證明了通過啟動Nrf2/HO-1通路能降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，對細胞損傷具有保護作用，如IcarisideⅡ通過Nrf2/HO-1降低氧化反應(yīng)對缺血性腦損傷起到保護作用，天麻素通過p38-MAPK磷酸化誘導(dǎo)Nrf2/HO-1上調(diào)從而減輕H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝竇內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激，綠原酸通過PI3K/Akt介導(dǎo)的Nrf2/HO-1信號通路對H2O2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細胞氧化應(yīng)激的保護作用，Embelin可激活Nrf-2/HO-1途徑，減輕順鉑引起的腎毒性，花青素通過PI3K/Akt/Nrf2/HO-1途徑減輕阿爾茨海默病小鼠模型中的氧化應(yīng)激[29-33]。

在以往研究中PPARγ在調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝方面有著重要的作用。而最近研究發(fā)現(xiàn)其在抗炎、抗氧化反應(yīng)調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著作用。PPARγ和Nrf2之間可能涉及多種機制的相互作用，從而在抗炎、抗氧化反應(yīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[31]。PPARγ可能與Nrf2啟動子上的過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件（peroxisome proliferator responsive element，PPRE）結(jié)合，激活 Nfr2 ，當氧化反應(yīng)增強時，PPARγ表達增加，即可上調(diào)Nrf2的表達，從而增強細胞對氧化應(yīng)激的抵抗能力[31-33]。本文采用熒光定量的方法檢測mRNA水平上Nrf2、HO-1、PPAR-γ的表達情況，相較于模型組，柴胡皂苷D組3個指標的表達均增加，可能表明柴胡皂苷D可上調(diào)Nrf2、HO-1、PPAR-γ基因的表達，增強細胞對氧化應(yīng)激反應(yīng)的抵抗能力。

綜上，柴胡皂苷D可能對H2O2誘導(dǎo)的心肌細胞損傷有保護作用，并可能通過激活 PPAR-γ/Nrf2/HO-1通路，增強心肌細胞對氧化應(yīng)激的抵抗能力，降低對細胞的損傷。