銀杏二萜內(nèi)酯對(duì)大鼠腦缺血再灌注后氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)抑制作用的研究

采用各種治療手段使堵塞血管再通、恢復(fù)血流灌注是臨床治療缺血性腦病的首選方案，但可能出現(xiàn)缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)并發(fā)癥，其機(jī)制與氧化應(yīng)激損傷和炎癥有關(guān)[1-3]。銀杏二萜內(nèi)酯類化合物為銀杏葉的主要有效成分，銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(DGMI)的主要有效成分為銀杏內(nèi)酯，其具有多種生物學(xué)活性，包括抗氧化[4-5]、抑制細(xì)胞凋亡[6]、抗炎[7]等。本研究將探討DGMI對(duì)腦I/R大鼠氧化應(yīng)激和炎癥是否具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用無病原微生物級(jí)SD大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(冀)2013-1-003]，體重230～250 g；適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物與試劑 DGMI(江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：5 mg∶1 mL，批號(hào)：20171124)；TUNEL試劑盒(南京建成生物工程研究所)；核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)抗體(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible NOS， iNOS)試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型復(fù)制與給藥 設(shè)假手術(shù)組(0.9%氯化鈉溶液)、I/R組(0.9%氯化鈉溶液)和DGMI低劑量組[1.5 mg/(kg·d)]、中劑量組[3 mg/(kg·d)]、高劑量組[6 mg/(kg·d)]，每組28只。參照陳鵬等[8]文獻(xiàn)報(bào)道的線栓法復(fù)制腦I/R大鼠模型，假手術(shù)組大鼠除不插入栓線，其余操作同手術(shù)組。精確稱量并加入適量0.9%氯化鈉溶液配制濃度為0.75 mg/mL(低劑量組用)、1.5 mg/mL(中劑量組用)、3 mg/mL(高劑量組用)的DGMI溶液，術(shù)后第2天各組分別按體積2 mL/kg給藥，假手術(shù)組和I/R組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，療程7 d。

1.3.2 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 行盲法10分制評(píng)分[9]。根據(jù)癥狀計(jì)分：上肢抱腕彎曲計(jì)1分，肘曲計(jì)2分，肩曲計(jì)3分，轉(zhuǎn)圈爬行計(jì)1分，據(jù)退檔阻力和肌肉張力下降程度分別計(jì)1～3分。

1.3.3 測(cè)定腦含水量和梗死體積百分比 ①各組分別按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)取6只大鼠，實(shí)施麻醉后取大腦組織，稱重(W1)后立即于110 ℃恒溫烘烤48 h至恒重，再次稱重(W2)，兩次重量差為失重(△W=W1-W2)，腦含水量(%)=(△W/ W1)×100%。②另各取6只大鼠大腦組織，-20 ℃冷凍15 min后沿冠狀2 mm厚度切片，然后避光下經(jīng)2%的TTC溶液孵育30 min(每5 min將切片翻轉(zhuǎn)1次)，最后運(yùn)用圖像分析軟件計(jì)算梗死體積百分比(蒼白色為更四區(qū))。

1.3.4 腦組織生化指標(biāo)檢測(cè) 另各隨機(jī)取10只大鼠缺血側(cè)大腦組織，加入適量冷裂解液后行組織勻漿，制備濃度為10%勻漿液。①一部分腦組織勻漿液經(jīng)4 ℃離心(3 000 r/min)15 min取上清液，然后比色法測(cè)定SOD、CAT、iNOS活性和MDA、NO含量；酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平。②領(lǐng)取一部分腦組織勻漿液經(jīng)4 ℃離心(12 000 r/min)20 min取沉淀，然后依次行沸水浴蛋白變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、春紅溶液染色、脫脂奶粉封閉后，一抗4 ℃孵育過夜，PBS溶液洗膜后行二抗室溫孵育1 h，然后行DAB顯色，測(cè)定條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，半定量分析NF-κB蛋白表達(dá)。

1.3.5 行腦組織病理學(xué)檢測(cè)和神經(jīng)元凋亡觀察 各取剩余6只大鼠大腦組織，經(jīng)10%甲醛溶液固定72 h后行石蠟包埋、2 μm厚度切片，脫蠟水化處理后，①行HE染色，由光學(xué)顯微鏡觀察缺血側(cè)腦組織病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)變化；②遵照試劑盒說明行TUNEL染色，由光學(xué)顯微鏡觀察缺血側(cè)腦組織神經(jīng)元凋亡狀況，并計(jì)數(shù)視野內(nèi)神經(jīng)元總數(shù)量和凋亡神經(jīng)元數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)(AI，%)=(凋亡神經(jīng)元數(shù)/神經(jīng)元總數(shù))×100%。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦含水量和梗死體積百分比測(cè)定結(jié)果 腦I/R損傷后神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦含水量和梗死體積百分比明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；較I/R組，經(jīng)DGMI中、高劑量治療7 d能夠明顯減低腦I/R大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦含水量和梗死體積百分比(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分、腦含水量和梗死體積百分比測(cè)定比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與I/R組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.2 氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 腦I/R損傷后SOD、CAT活性明顯降低，且MDA含量明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；較I/R組，經(jīng)DGMI中、高劑量治療7 d后能夠明顯提高SOD、CAT活性，并降低MDA含量(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

表2 大鼠缺血側(cè)腦組織氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與I/R組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.3 iNOS活性和NO含量測(cè)定結(jié)果 腦I/R損傷后缺血側(cè)iNOS活性和NO含量均明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；較I/R組，經(jīng)DGMI中、高劑量治療7 d能夠明顯降低iNOS活性和NO含量(P<0.05或P<0.01)。詳見表3。

表3 各組大鼠缺血側(cè)腦組織iNOS活性和NO含量比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與I/R組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.4 炎癥細(xì)胞因子含量測(cè)定結(jié)果 腦I/R損傷后缺血側(cè)腦組織TNF-α、IL-1β、IL-6含量明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；較I/R組，經(jīng)DGMI中、高劑量治療7 d能夠明顯降低TNF-α、IL-1β、IL-6含量(P<0.05或P<0.01)。詳見表4。

表4 各組大鼠腦組織炎癥細(xì)胞因子含量比較(±s)

與假手術(shù)組比較，1)P<0.01；與I/R組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.5 腦組織病理學(xué)檢查結(jié)果 假手術(shù)組未見異常；腦I/R組缺血側(cè)腦組織神經(jīng)元出現(xiàn)明顯形態(tài)結(jié)構(gòu)病理性改變，包括神經(jīng)元數(shù)量減少，胞漿固縮、空泡變性，胞質(zhì)著色不均、胞核深染等；較I/R組，經(jīng)DGMI治療7 d能夠明顯改善I/R所致神經(jīng)元病變，其作用呈現(xiàn)一定劑量依賴性，DGMI高劑量組效果較DGMI中、劑量更為顯著。詳見圖1。

A為假手術(shù)組；B為I/R組；C為DGMI低劑量組；D為DGMI中劑量組；E為DGMI高劑量組

2.6 神經(jīng)元凋亡狀況觀察結(jié)果 假手術(shù)組未見凋亡神經(jīng)元；I/R組凋亡神經(jīng)元大量出現(xiàn)，而較I/R組，經(jīng)DGMI不同劑量治療7 d能夠減少凋亡神經(jīng)元數(shù)量，尤其DGMI高劑量組。計(jì)算AI發(fā)現(xiàn)，I/R組AI較假手術(shù)組顯著升高[(64.85±8.24)%與(2.35±1.17)%，P<0.01]，而較I/R組，DGMI中、高劑量組AI顯著降低[(40.62±6.17)%與(16.18±3.64)，P<0.01]。詳見圖2。

A為假手術(shù)組；B為I/R組；C為DGMI低劑量組；D為DGMI中劑量組；E為DGMI高劑量組

2.7 腦組織NF-κB蛋白表達(dá) 檢測(cè)每組10只大鼠腦I/R損傷后缺血側(cè)腦組織NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.63±0.09)與(0.07±0.02)%，P<0.01]；較I/R組，經(jīng)DGMI中、高劑量治療7 d能夠顯著降低NF-κB蛋白表達(dá)[(0.35±0.12)%、(0.24±0.07)%與(0.63±0.09)%，P<0.05或P<0.01]；DGMI低劑量NF-κB蛋白表達(dá)與I/R組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.48±0.12)與(0.63±0.09)%，P>0.05]。詳見圖3。

A為假手術(shù)組；B為I/R組；C為DGMI低劑量組；D為DGMI中劑量組；E為DGMI高劑量組

3 討 論

I/R損傷病理機(jī)制非常復(fù)雜，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，氧化應(yīng)激和炎癥在其發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[10-11]，因此可以將二者作為新藥研究的靶點(diǎn)。DGMI主要有效成分為銀杏內(nèi)酯，本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DGMI治療7 d能夠降低腦I/R損傷大鼠神經(jīng)功能損傷，降低腦水腫和腦梗死體積，降低腦組織神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)病理性改變和神經(jīng)元凋亡，說明DGMI對(duì)大鼠腦I/R損傷具有保護(hù)作用。

體內(nèi)氧自由基(ROS)是代謝產(chǎn)物，生理狀態(tài)下能夠在SOD、CAT的相繼作用下被催化還原而消除其危害[12]，但在I/R病理狀態(tài)下，ROS大量生成且SOD、CAT被過度消耗，導(dǎo)致體內(nèi)ROS過剩而引發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞膜不飽和脂肪酸、染色質(zhì)等被過氧化而遭到破壞，而MDA為過氧化反應(yīng)終產(chǎn)物之一[13]。NO是重要的細(xì)胞間信號(hào)傳遞分子，具有非常重要的生理功能，但在炎癥等病理狀態(tài)下，激活的誘導(dǎo)型iNOS能夠催化生成大量NO，其與ROS生成ONOO-和N2O3，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷和亞硝基化損傷[14]。TNF-α、IL-1β、IL-6是監(jiān)測(cè)炎癥的常用指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DGMI治療7 d能夠提高腦I/R損傷大鼠缺血側(cè)腦組織SOD、CAT活性，降低MDA、NO含量，降低TNF-α、IL-1β、IL-6，說明具有抑制腦I/R大鼠氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)的作用。

神經(jīng)元凋亡是腦I/R繼發(fā)性損傷的主要形式，是NF-κB蛋白氧化應(yīng)激誘發(fā)細(xì)胞凋亡的重要分子橋梁[15]。受ROS攻擊而活化的NF-κB蛋白一方面能夠與凋亡相關(guān)基因c-myc等結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，另一方面能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞活化和浸潤、誘導(dǎo)促凋亡信號(hào)釋放而促使細(xì)胞凋亡[16]。

綜上所述，DGMI可能通過抑制氧化應(yīng)激損傷和炎癥而表現(xiàn)出對(duì)大鼠腦I/R損傷的保護(hù)作用。