受磷蛋白磷酸化調控在心肌缺血再灌注損傷中的作用

李園園，劉愛華

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是缺血心肌在恢復血液灌注后，引起超微結構、心功能、能量代謝和電生理方面發生進一步的損傷。發生MIRI時肌漿網(sarcoplasmic reticulum， SR)中Ca2+循環(包括SR Ca2+釋放和攝取)異常導致心肌功能受損。心肌SR的Ca2+攝取主要由2型肌漿網鈣泵(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase 2a，SERCA2a)完成。受磷蛋白(phospholamban， PLN /PLB)被認為是直接參與心臟疾病發展的SERCA2a相關蛋白[1]。PLN的磷酸化修飾改變肌漿網鈣泵的結構和功能，控制SR鈣攝取進而改變心肌功能，參與心臟生理功能及疾病的調控。本研究對PLN磷酸化調控在心肌缺血再灌注損傷(MIRI)中的作用做一綜述。

1 SERCA/PLN轉運復合物的結構和功能

心肌胞質鈣穩態主要是幾種關鍵的心肌SR鈣轉運蛋白調節的結果。心肌興奮時膜去極化，L型Ca2+通道開放引起Ca2+內流，激活SR上的2型蘭尼堿受體(ryanodine receptor， RyR2)，進一步誘導SR釋放更多Ca2+[2]。胞質Ca2+濃度的升高，引起心肌收縮。同時SR上的SERCA2a激活，升高的Ca2+被主動攝回SR及被胞膜上的鈉鈣交換體(Na+/Ca2+-exchanger， NCX1)泵出胞外，導致胞內Ca2+回落，引起肌肉松弛。

鑒于哺乳動物心肌細胞舒張期70%，甚至80%以上(小嚙齒動物93%)的Ca2+通過SERCA2a攝回至SR，SERCA2a是使心肌舒張期胞內鈣濃度下降的主要因素。盡管SERCA2a與一系列的蛋白相互作用(包括HRC、PP1、calreticulin、S100A和sarcolipin)，PLN對調節SERCA2a活性至關重要。因此，兩者構成的SERCA/PLN轉運復合物的結構和功能備受關注，并被廣泛研究。

1.1 SERCA2a的結構和功能 SERCA2a為主要的心臟異構體。SERCA2a是分子質量約為110 kDa的跨膜蛋白，占心肌內SR總蛋白含量的40%。SERCA2a的功能是調控SR的Ca2+回攝。在心臟中，SERCA2a的活性控制胞質Ca2+去除速率和SR Ca2+負載程度，是心臟舒張和收縮的基本決定因素。在心臟中過表達SERCA2a蛋白的轉基因小鼠表現出增強的SR Ca2+轉運和心肌收縮力[3]。然而心臟特異性敲除SERCA2的小鼠即使在心肌細胞沒有可檢測到的SERCA2蛋白水平也能存活7周，但8周后心臟舒張和收縮功能嚴重下降引起高死亡率，由此推測似乎只有在NCX代償機制失敗時SERC2a含量的降低才對心功能產生不利影響[4]。

1.2 PLN的結構和功能 PLN是由52個氨基酸組成的小整合膜蛋白，具有3個獨特的可磷酸化位點(Ser10、Ser16和Thr17)[5]，主要以單體(6 kDa)和五聚體(30 kDa)存在。PLN的單體形式是抑制SERCA2a的主要種類。最近有證據表明PLN的五聚體也能夠結合SERCA2a[6]，但其功能尚未被闡述。在功能上，PLN是SR上SERCA2a的主要調節因子[7]，通過直接抑制SERCA2a對SR Ca2+的攝取來負向調節細胞內Ca2+的去除。因此，PLN/SERCA2a比率是基礎收縮力的關鍵決定因素。

2 MIRI中PLN的磷酸化調控

SR在再灌注伊始就控制胞質鈣超載的命運，被認為是防治MIRI的主要靶標[8]。SERCA2a過表達可以通過減輕鈣超載來對抗缺血再灌注心律失常作用，改善收縮功能[9]。

2.1 PLN的磷酸化對SERCA2a的調節 目前已經明確PLN的活性受到兩個殘基磷酸化的嚴格調控：由PKA介導的Ser16位點和由CaMKⅡ介導的Thr17位點磷酸化。

2.1.1 PLN雙位點的磷酸化對SERCA2a的調節 1998年Luo等[10]用轉基因的方法對雙位點磷酸化進行研究，認為Ser16的磷酸化是Thr17磷酸化的前提條件，從此拉開了用9～19位殘基上的PLN多肽研究PLN雙位點磷酸化的序幕。首先在1999年，Currie等[11]在心功能衰竭兔左心室中觀察到PLN Ser16和Thr17磷酸化水平都升高，但磷酸化增加的機制并不清楚。2002年，Vittone等[12]對不同時間點離體大鼠心臟缺血再灌注損傷(IRI)中PLN的磷酸化狀態進行監測，發現Ser16磷酸化在缺血20 min后顯著增加，可以被PKA抑制劑H-89取消，但在再灌注后立即恢復正常；而Thr17磷酸化在缺血2～5 min和再灌注1 min時瞬時增加，可被CaMKⅡ抑制劑KN93減輕。Said等[13]在2003年用Ala替代Ser16或Thr17后發現，PLN-S16A小鼠僅在再灌初期受損，PLN-T17A小鼠的心功能恢復在整個再灌注時期都嚴重受損，說明盡管兩種位點磷酸化都參與缺血后的機械恢復，但Thr17位點似乎起主要作用。上述研究表明PLN雙位點的磷酸化增加對IRI都具有心臟保護作用。

2.1.2 PLN單一位點的磷酸化對SERCA2a的調節 隨著Thr17磷酸化被發現在增加心臟刺激頻率、胞內鈣濃度升高、IRI及酸中毒時并不依賴于Ser16[14-15]，隨后PLN單一位點的磷酸化研究出現了大相徑庭的結果。

2.1.2.1 PLN的Ser16位點磷酸化 首先是Xie等[16]發現缺血30 min和再灌注1 min時Ser16磷酸化增加，但在再灌注30 min時降低。隨后發現豬未成熟心臟IRI后[17]PLN的Ser16位點磷酸化降低。最近的研究表明心肌梗死病人左心室肌PLN Ser16磷酸化降低[18]。因此，在IRI及梗死心肌，心臟功能的降低都與PLN的Ser16位點磷酸化降低相關。

2.1.2.2 PLN的Thr17位點磷酸化 與Ser16位點一致，短暫缺血再灌引起Thr17位點PLN的磷酸化水平下降。大鼠離體心臟缺血30 min時，再灌注30 min時與異丙腎上腺素誘導的磷酸化[16]和缺血前心肌[19]相比，Thr17位點的磷酸化水平降低，還伴有CaMKⅡ的活性降低[19]。之后在CaMKⅡδ異構體特異性敲除的小鼠心肌發現Thr17磷酸化降低，使心肌細胞舒張期SERCA2a回攝Ca2+的速率減慢，舒張功能受損[20]，但并未改變SR的Ca2+含量。在體證據也顯示：小鼠缺血30 min再灌注30 min后CaMKⅡ介導的Thr17位點的PLN磷酸化水平降低是SERCA2a活性下調的直接原因[21]。上述實驗研究提示：可通過CaMKⅡ的活化來增加Thr17位點的PLN磷酸化而增強SERCA2a活性，防止Ca2+超載和限制細胞死亡，幫助缺血后的機械恢復而減少再灌注損傷。

與上述研究相悖，Inserte等[22]發現繼續延長缺血時間到40 min，再灌注3 min時顯示大鼠心肌Ser16和Thr17的磷酸化達到頂峰，隨后會衰退，在再灌注10 min時檢測不到。而對再灌注開始時瞬時抑制PKA和CaMKⅡ從而抑制PLN的磷酸化，獲得了類似心臟保護作用，故認為減少再灌注開始時的PLN磷酸化能夠減輕IRI。分析其原因可能為CaMKⅡ的作用靶點除了PLN，還有肌漿網鈣釋放通道RyR2的磷酸化也發生改變。由于CaMKⅡ同時介導的Thr17位點PLN磷酸化和S2814位點上RyR2的磷酸化，對心臟起到了雙刃劍的作用：雖然PLN磷酸化恢復SERCA2的攝鈣功能有保護作用，但是此時S2814位點上RyR2的磷酸化導致RyR功能增強，加劇SR鈣泄漏[23-24]。當CaMKⅡ對SR鈣泄漏的促進作用超過其促進SERCA再攝取鈣的保護效應時，即促進心功能障礙的發展。

PLN磷酸化對SERCA2a的調節及缺血心臟功能的影響可能隨著疾病的進程不同而變化，受到模型缺血時間、動物種屬、樣本來源、抗體種類和比較的標準影響，尤其是CaMKⅡ的雙刃劍作用使得人們在將PLN磷酸化作為防治缺血再灌注損傷的靶點時，需要兼顧SR鈣攝取功能的恢復和SR鈣泄漏的傾向，維持SR鈣攝取和鈣泄漏之間的平衡。

2.2 PLN去磷酸化對SERCA2a的調節 除了蛋白激酶可催化PLN磷酸化，蛋白磷酸酶可催化PLN發生去磷酸化。目前PLN去磷酸化對SERCA2a的調節研究主要集中在絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶。

早期的研究表明蛋白磷酸酶1(PP1)是主要的去磷酸化PLN的磷酸酶，其活性在心力衰竭病人心臟顯著升高。在心臟SR，PP1被內源性抑制劑inhibitor(I-1和I-2)所調節，因此，其抑制劑I-1和I-2常被用來進行關于PP1作用的研究。隨后發現在人衰竭的心臟由于I-1蛋白水平和磷酸化的減少，導致磷酸酶活性增加，Ser16位點上的PLN磷酸化降低[25]。因此，PP1被認為是心臟功能主要負調節因子。

蛋白磷酸酶1(PP1)和蛋白磷酸酶2(PP2)被發現在IRI異常的SR鈣循環中發揮作用。早年人們觀察到缺血30 min再灌注30 min致IRI大鼠心臟中SR蛋白磷酸酶活性[19， 26]，PP1和PP2A的活性都比缺血前有所降低[19]。然而近年來對IRI大鼠蛋白磷酸酶的研究卻顯示相反的變化。首先是在大鼠心臟左前降支結扎20～30 min造模后，與非危險區相比，危險區心肌PLN在Ser16位點和Thr17位點磷酸化減少，SR攝鈣功能受損而誘發再灌注時鈣超載，其機制為缺血增強PP2B活性，激活PKC-α，使I-1 失活而間接激活PP1[27]。隨后有報道延長再灌時間到120 min的IRI大鼠心肌中PP1α的蛋白表達比對照組顯著上升，損害了心肌收縮和舒張功能[28]。另外，在IRI后24 h遠端未缺血心肌中PLN的Ser16磷酸化水平降低，這種降低與PKA無關，而是PP2A活性升高去磷酸化增加引起的[7]。造模方式、缺血或再灌時間和比較標準的差異，加上蛋白磷酸酶的亞型繁多，造成了PLN去磷酸化在IRI心肌表現迥異。上述差異也提示在IRI早期機體可能存在代償機制，磷酸酶活性降低使PLN去磷酸化減少，促進SR鈣攝取保護心臟功能，而隨著病情加重進程延長，機體失代償激活磷酸酶促進PLN去磷酸化，導致再灌注時鈣超載引起心肌損傷。值得注意的是，能催化Thr17位上PLN磷酸化的CaMKII自身磷酸化受到PP1、 PP2等調節，能催化Ser16位上PLN磷酸化的PKA，又能激活PP1的內源性抑制物I-1，使得PLN磷酸化調控變得更加錯綜復雜。

3 結 語

蛋白激酶和蛋白磷酸酶共同構成了PLN磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質活性的開關系統。激酶和磷酸酶分別與PLN相互作用，調節SERCA2a的功能從而影響鈣穩態，精細調控SR的鈣攝取和貯存。目前對激酶在MIRI鈣循環異常中的作用進行了詳盡的探討，但對磷酸酶的研究方興未艾。接下來需要大量的工作對不同時間點IRI的磷酸化以及磷酸酶進行研究，以期維持這一開關系統的動態平衡，為MIRI發病機制及精準治療提供新的理論依據和新的思路。