線粒體介導遠端缺血后處理抗腦缺血再灌注損傷的機制研究進展

陶苗苗，徐鳴曙，張英杰，程愛芳，鄧韻怡

1.上海中醫藥大學，上海市 200120；2.上海市針灸經絡研究所，上海市200030

大腦對缺血缺氧十分敏感，長時間處于缺氧或缺血狀態，會使缺血區域組織發生不可逆壞死。主要治療措施是盡快恢復該區域腦血流灌注，但缺血腦組織被血流再次灌注，會造成嚴重的二次傷害。目前針對腦缺血的干預，急性期大多采用靜脈溶栓，但大多數患者不能在短暫的時間窗內得到有效治療[1]；腦缺血后，阻斷缺血損傷的級聯反應，減少或緩解神經元損傷則是另一思路[2]。訖今仍沒一種應用廣泛并行之有效的方法可以預防或減少腦缺血再灌注損傷。

1 遠端缺血后處理

缺血后處理的概念由Zhao 等[3]于2003 年首次提出。Keren?di 等[4]發現，在缺血再灌注前實施短時間腎臟缺血再灌注，能明顯減少實驗鼠心肌梗死范圍，提出遠端缺血后處理的概念。Ren 等[5]的研究證明肢體缺血后處理對大腦的保護作用。經過逐步完善，現在認為，機體重要組織器官缺血后，在再灌注前對遠離靶器官的非重要器官或組織進行反復、短暫缺血再灌注，可使長期缺血的組織器官在恢復血流后即刻充血過程受到調節，有效調動機體內源性保護機制，減輕再灌注損傷[6]。

2 遠端缺血后處理方法

根據對遠端肢體的處理方法，遠端缺血后處理可分為有創和無創兩種[7]。有創的方法，如李富瑩[8]對大腦中動脈閉塞栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注大鼠，于雙側腹股溝處分離股動脈，用蛙心夾夾閉、放開行缺血再灌注治療。無創的方法，如許士民[9]對MCAO 再灌注大鼠，用橡皮筋扎緊大鼠雙下肢根部，以雙下肢足背動脈搏動消失、皮膚溫度下降、皮膚紫紺、肢體發脹作為阻斷成功標志，松開橡皮筋，使股動脈恢復血流。

根據遠端肢體的處理時間，可分為快速和延遲兩種。快速處理，如MCAO 大鼠拔出栓線后5 min，即對大鼠雙側股動脈進行缺血再灌注處理[10]。延遲處理，如對MCAO大鼠，輪流夾閉雙下肢股動脈2 min后灌注2 min，連續5 d[11]。

根據缺血部位，可分為上肢和下肢。臨床多采用血壓計纏繞上臂加壓肱動脈，如何潔等[12]將血壓計纏繞腦卒中患者上臂，加壓維持180～200 mmHg，持續5 min，恢復5 min；每次5 個循環，每天2 次，連續治療半年。而動物實驗多選用下肢股動脈作為缺血處理的對象。

3 線粒體與腦缺血再灌注損傷

線粒體存在于大多數細胞中，除了為細胞提供能量外，還承擔其他許多生理功能，如參與調控細胞內鈣穩態、氧自由基產生、細胞凋亡和自噬，以及細胞信號轉導等[13]。應激狀態下，以介導細胞凋亡為主[14]。

3.1 線粒體和細胞凋亡

線粒體功能障礙是再灌注誘導腦細胞死亡的關鍵因素之一[15]。導致線粒體結構破壞的事件，如膜電位改變、鈣離子超載、線粒體體積改變和凋亡因子釋放等，都會誘導細胞凋亡[16]。細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷引起細胞死亡的重要形式[17]：細胞收縮后，細胞內DNA 程序化降解，細胞色素C 釋放增多，caspases被激活[18]。

3.2 細胞凋亡與腦缺血再灌注損傷

腦缺血再灌注損傷涉及一系列復雜的病理過程[19]，這些病理過程會破壞線粒體的形態和功能。缺血再灌注期間，細胞內環境突然改變、線粒體膜電位變化、鈣離子內流增加等，會導致線粒體通透性轉換孔突然打開，線粒體外膜破裂，繼而形成線粒體水腫，并可導致來自線粒體膜間隙的促凋亡因子如細胞色素C 釋放；外滲的細胞色素C 可激活caspase?9，進而活化凋亡執行蛋白caspase?3，最終使細胞凋亡[20]。

4 遠端缺血后處理的線粒體機制

細胞凋亡的調控有許多凋亡基因參與，而線粒體是這一調控程序的核心機制[21?22]。研究顯示[23]，無創延遲肢體缺血預處理可促進腦缺血再灌注大鼠線粒體ATP敏感性鉀通道開放，抑制線粒體通透性轉換孔開放，減小腦缺血再灌注損傷后腦梗死面積，改善神經功能障礙。

4.1 細胞色素C

線粒體內膜向內折疊形成嵴，附著許多有重要作用的蛋白質，如細胞色素[24]。正常情況下，細胞色素C 不能通過外膜；如果線粒體外膜破裂或通透性發生改變，細胞色素C 之類的促凋亡蛋白就會被釋放入細胞質。

細胞色素C 是細胞凋亡的觸發因素之一。釋放的細胞色素C 通過損害線粒體功能，激活caspase，誘導細胞凋亡[25]。采用顯微注射技術將細胞色素C 注入細胞內，可誘導多種細胞類型凋亡[26]。腦缺血再灌注損傷后，細胞色素C 從線粒體釋放到胞漿[27]，啟動細胞凋亡[25?27]。邢變枝等[28]發現，經過遠端缺血后處理的缺血再灌注模型大鼠，神經細胞內細胞色素C 漏出減少。Wang 等[29]的研究證實，短暫重復循環缺血后處理可減少短暫全腦缺血再灌注引起的神經細胞死亡和學習記憶障礙，可能與抑制細胞色素C 釋放，進而阻斷神經細胞凋亡有關。遠端缺血后處理抑制線粒體細胞色素C釋放的機制尚不清楚。

4.2 線粒體自噬

線粒體自噬由Lemasters[30]于2005 年提出。線粒體自噬是細胞為了維持自身內部環境穩定，通過降解受損的、自身不需要的線粒體，調整線粒體數量和能量代謝平衡的過程，對維持生物體正常生長發育至關重要[31?32]。

線粒體自噬能清除受損線粒體，維持細胞內環境穩定，緩解腦缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡[33]。自噬在腫瘤、炎癥、衰老，以及胚胎發育過程中也有重要的保護作用[34]。

線粒體自噬在腦缺血再灌注損傷中的作用尚未明確。研究表明[35]，自噬通路的過度激活與許多疾病狀態相關，受損線粒體的清除超出正常范圍會導致細胞死亡，加重腦損傷。腦缺血再灌注后，線粒體外膜蛋白BNIP3表達增加，并過度激活線粒體自噬，引發遲發性神經細胞死亡，加重腦缺血再灌注損傷[36]。過度自噬也會加速線粒體裂解，同樣加重細胞損傷[37]。

另有研究發現[38?39]，早期應用遠端缺血后處理觸發更多自噬開關分子，誘導復雜的自噬調控，從而減少線粒體損傷，提供即時神經保護。周密[40]發現，遠端缺血后處理能上調Parkin和DJ?1 蛋白表達水平，促進其向線粒體轉位，從而增強線粒體自噬，產生腦保護作用。

線粒體自噬水平升高呈現截然相反的結果，我們推測，自噬作為一種自身“清潔”機制，應維持在合理范圍內，過低起不到腦保護作用，過高則會帶來相反的結果。

4.3 線粒體ATP敏感性鉀通道

ATP 敏感性鉀通道是一種非電壓依賴性的配體門控通道，主要參與細胞代謝和電活動，涉及的門控因素為細胞內ATP和ADP 水平[41]。線粒體ATP 敏感性鉀通道開放引發鉀離子內流，降低鈣離子內流，減輕或避免鈣超載引起的線粒體腫脹和分解等，保護線粒體功能，減輕細胞損傷[42?44]。大腦中的線粒體K?ATP 通道密度比其他器官和組織更大[45]，提示線粒體K?ATP 通道對神經細胞具有潛在的保護作用。線粒體ATP敏感性鉀通道開放可抑制caspase?3活性，預防神經細胞凋亡，對腦缺血再灌注產生保護作用[46]。二氮嗪是線粒體K?ATP通道的選擇性開放劑。二氮嗪后處理聯合預處理對大鼠心臟缺血再灌注損傷有保護作用，與開放線粒體ATP敏感性鉀通道，維護線粒體功能有關[47]。調節線粒體ATP 敏感性鉀通道有望成為緩解腦缺血再灌注損傷的一種治療途徑。有研究發現[48]，肢體缺血后處理對局灶性腦缺血再灌注損傷有神經保護作用，而K?ATP選擇性阻斷劑5?hydroxydecanoate可使保護作用消失。Sun 等[49]發現，延遲遠端缺血后處理可減少局灶性腦缺血損傷，其機制和K?ATP通道的開放有關。

4.4 線粒體膜通透性轉運孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)

MPTP 位于線粒體內外膜間，是線粒體合成ATP 的重要場所，一般處于關閉狀態，通透性具有選擇性；當其開放后，可允許各種離子和大分子自由通過線粒體膜。如長時間處于開放狀態，會引起線粒體腫脹和功能障礙，最終導致線粒體死亡。

MPTP 的開放與腦缺血再灌注損傷關系密切[50]。腦缺血再灌注期間MPTP 開放，引發細胞內鈣超載、自由基和游離脂肪酸大量生成，以及興奮性氨基酸釋放等，造成線粒體合成障礙和形態變化，導致神經元死亡。大鼠MCAO 30 min 后再灌注30 min，腦缺血后處理組腦梗死面積明顯減少，線粒體通透性轉換降低[51]，提示腦缺血后處理的腦保護作用可能與抑制MPTP 開放有關；遠端缺血后處理的腦保護作用有時間依賴性，再灌注即刻缺血后處理保護作用明顯。另有研究顯示[52?53]，缺血再灌注會降低打開MPTP 所需的鈣離子濃度閾值，而遠端缺血后處理可使其閾值趨向正常，從而抑制MPTP 的開放。MPTP有望成為治療缺血再灌注損傷的靶點。

5 小結

線粒體功能對細胞內環境穩定和缺血再灌注環境中細胞存活均有重要意義。遠端缺血后處理操作簡單方便，有很好臨床應用價值；隨著遠端缺血后處理研究的不斷深入，線粒體機制正成為腦保護的研究熱點。

關于線粒體途徑的研究還有很多具體問題尚未解決。①動物模型：雖然多種動物模型研究都證明，線粒體途徑在對遠端缺血后處理的腦保護中發揮重要作用，但不同模型得出的結論是否具有可比性，仍有待進一步驗證。②遠端缺血處理方式：研究者對實驗動物進行遠端缺血后處理的方式有所區別，其具體作用機制或通路未必相同。③時間窗：現有研究并未明確何時介入遠端缺血后處理能對腦缺血再灌注損傷發揮最大保護效應。

為深入研究遠端缺血后處理緩解腦缺血再灌注損傷的線粒體機制，未來研究應闡明不同動物模型和處理方式的異同，揭示遠端缺血后處理發揮明確效應的時間窗，為腦卒中治療及改善預后提供新的治療靶點和方案。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。